应用基因谱系示踪技术揭示小鼠Tbx18+EPCs向心系细胞分化潜能的实验研究

第一部分，Tbx18-Cre基因敲入小鼠的繁殖和鉴定
　　基因工程小鼠在认识基因的功能、建立人类遗传性疾病的动物模型方面被认为是最佳动物模型。在整体动物表型水平研究胚胎心脏发育过程及心肌损伤修复中，基因工程小鼠也是目前最流行和有效的功能基因组研究手段。利用基因谱系示踪技术研究心脏祖细胞的分化命运，更是关键技术手段。但是，基因工程小鼠的品系繁殖及基因型鉴定需要成熟的技术平台。T-box转录因子18(Tbx18)是T-box家族的重要转录因子之一，对哺乳动物心脏发育形成起重要的调节作用。如何示踪胚胎心脏发育过程中转录因子Tbx18为标记的细胞群的分化命运，存在一定技术难度。利用Tbx18-Cre Knock in小鼠和Cre报告小鼠建立Tbx18-Cre/Rosa26RYFP/LacZ磁双杂合Knock in小鼠模型，为解决示踪Tbx18为标记的心脏祖细胞群分化命运难题的可行方案。
　　目的：优化提取基因组的方法，建立快速大批量鉴定、筛选Tbx18-Cre Knock in杂合子小鼠的研究平台，为建立双杂合基因谱系示踪模型提供关键技术保障。
　　方法：将Tbx18-Cre Knock in杂合子雄性小鼠与同背景的C57BL/6雌性小鼠交配，应用新的一管酒精基因组抽提法，筛选、鉴定出一批子代杂合Tbx18-Cre Knock in小鼠。通过凝胶电泳基因组DNA和分光光度法检测DNA纯度和浓度、酶切全基因组、聚合酶链式反应(PCR)判断一管酒精抽提法的基因组质量。Tbx18-Cre子代鼠通过PCR鉴定，根据杂合子阳性率判定遗传信息是否符合孟德尔遗传规律，初步判断是否存在基因遗漏现象。
　　结果：(1)经过基因组电泳分析DNA质量、分光光度法检测DNA纯度，显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚/氯仿提取法提取的基因组质量没有明显差别；两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠；酶切全基因组后，两种方法获得的基因组都可以被酶完全切开。(2)利用一管酒精抽提法提取的基因组，PCR扩增鉴定Tbx18-Cre子代鼠，阳性率为51.6％，基本符合孟德尔遗传规律。Rosa26EYFP和Rosa26LacZ的子代阳性小鼠比例也基本符合孟德尔遗传规律。
　　结论：(1)利用一管酒精抽提法提取的基因组，基因组质量良好，用于PCR鉴定转基因小鼠结果稳定、可靠；酶切反应完全，还可以用于Southern杂交等后续实验。因此，我们成功建立快速、大批量鉴定、筛选转基因小鼠的研究平台。(2)我们筛选、鉴定的Tbx18-Cre、Rosa26EYFP、Rosa26LacZ杂合子子代小鼠未发现基因遗漏现象，这些基因敲入小鼠保种和鉴定成功，为我们后续实验提供了最关键保障。
　　第二部分，胚胎心脏发育过程中Tbx18+细胞分化命运示踪模型的建立
　　如何在体内、外示踪转录因子Tbx18为标记的心脏祖细胞群的分化命运，存在一定技术难度。因此，利用基因谱系示踪技术，建立Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ双杂合小鼠模型，为解决在胚胎心脏发育过程中示踪标记Tbx18+细胞分化命运难题的可行方案。
　　目的：尝试通过基因和蛋白两个方面鉴定Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ双杂合Tbx18+细胞及其分化细胞示踪模型是否成功。
　　方法：(1)大体观察Tbx18Cre/Cre小鼠可导致发育异常、致死性特征，初步判断Tbx18-Cre小鼠Cre表达是否特异。(2)将雌性杂合Tbx18-Cre Knock in小鼠和雄性条件性Cre报告系统小鼠Rosa26EYFP和Rosa26LacZ交配，在其子代小鼠中PCR法筛选、鉴定Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ双杂合模型。(3)原位杂交法检测胚胎Tbx18mRNA的表达，X-gal染色检测示踪模型LacZ的表达，FACS分选纯化EYFP+细胞。
　　结果：(1)大体观察到Tbx18Cre/Cre小鼠导致发育异常、致死性特征；(2)Tbx18mRNA的表达部位与Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ双杂合小鼠模型的报告基因表达部位基本一致；(3)通过FACS分选EYFP+细胞，在体外获得以转录因子Tbx18为标记的示踪细胞系。
　　结论：(1)Tbx18Cre/Cre小鼠具有knock-in knock-out内源性Tbx18的作用，Tbx18Cre小鼠可用于建立Tbx18+细胞命运示踪模型；(2)早期胚胎Tbx18mRNA的表达部位与Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ双杂合小鼠模型的报告基因表达部位基本一致，判断Cre的表达可特异性反应内源性Tbx18的表达，验证该模型可以可靠的在体内示踪Tbx18+细胞及其分化细胞命运，解决其体内示踪Tbx18为标记的心脏祖细胞群的分化命运难题。(3)利用FACS分选纯化EYFP+细胞，最后成功在体外分选出纯化的EYFP+细胞，解决了体外示踪Tbx18为标记的心脏祖细胞群的分化命运难题。
　　第三部分，Tbx18在胚胎心脏发育过程中的表达及其命运示踪
　　胚胎心脏心外膜是一种新的心肌细胞来源。Wt1是心外膜的标志，Wt1+心外膜祖细胞(EPCs)具有向心系细胞分化的多潜能性。但是，Tbx18是否定位于心外膜，Tbx18+EPCs是否存在还不明确。因此，阐明Tbx18+EPCs质疑问题具有重要意义。
　　目的：阐明Tbx18是否定位于早期胚胎心脏的心外膜，进而在组织水平揭示Tox18+心外膜是否可以分化形成心肌。
　　方法：原位杂交法检测早期胚胎心脏Tbx18mRNA的定位；免疫荧光和X-gal染色分别检测示踪模型EYFP和LacZ的定位；免疫荧光双标和免疫组化双标检测Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ模型心外膜的性质。
　　结果：(1)整胚原位杂交染色显示Tbx18mRNA在E11.5天前小鼠胚胎前体心外膜和心外膜表达；组织切片提示E11.5天前Tox18mRNA表达定位在心外膜表达，心肌组织中没有Tbx18mRNA的表达。(2)整胚Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠X-gal染色显示LacZ表达于E11.5前前体心外膜及心外膜；组织切片提示LacZ表达定位在E11.5天前心外膜表达，心肌组织中没有LacZ的表达。(3)E11.5天前Tbx18-Cre/Rosa26YFP小鼠EYFP蛋白表达于心外膜，心肌内没有EYFP蛋白的表达；E11.5天前心外膜免疫荧光双标揭示EYFP阳性组织不与cTNT阳性组织融合。(4)E11.5天后Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠胚胎心脏LacZ在心房、心室、室间隔、心脏血管表达。利用免疫组化双标法提示E16.5天胚胎心脏Tbx18蛋白与心外膜表达的报告基因LacZ重叠，而室间隔等心肌内部没有Tbx18蛋白的表达。室间隔表达的LacZ代表由心外膜细胞分化形成，而非Tbx18蛋白原位表达所致。
　　结论：(1)E11.5天前Tbx18mRNA表达定位在心外膜，此阶段小鼠心外膜是具有非心肌组织性质；而心肌组织中没有Tbx18的表达；因此，Tbx18是胚胎心外膜的标志之一。(2)Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠模型提示E11.5天后胚胎心房、心室、室间隔、冠状血管等心脏组织可来源于Tbx18+心外膜。
　　第四部分，胚胎心脏Tbx18+EPCs向心系细胞分化潜能的实验研究
　　心脏祖细胞是具有向心肌细胞、血管平滑肌细胞、心脏起搏细胞等主要心系细胞多潜能分化特性的细胞群。心脏Tbx18+EPCs是否具有心系细胞多向潜能分化特性，对判定其是否是一种心脏祖细胞类型具有重要意义。
　　目的：在细胞水平揭示Tbx18+EPCs是否具有心脏祖细胞的心系多潜能分化特性。
　　方法：利用Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ示踪小鼠模型，通过免疫荧光双标技术，鉴定心脏组织中来源于Tbx18+EPCs的细胞类型及性质。
　　结果：来源于Tbx18+EPCs的心脏组织细胞可表达肌钙蛋白cTNT、平滑肌肌球蛋白重链MYH11蛋白、HCN4蛋白，但是不能表达血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)。
　　结论：来源于Tbx18+EPCs的心脏组织细胞具有心肌细胞、血管平滑肌细胞、心脏起搏细胞的特性，但不具有血管内皮细胞的特性。因此，Tbx18+EPCs具有向心肌细胞、血管平滑肌细胞、心脏起搏细胞等心系细胞分化的多潜能性。
　　第五部分，Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏形成的影响
　　成年小鼠的心脏属于终末分化组织，目前还没有证明其具有再生潜能。胚胎、新生、成年期小鼠心脏组织细胞的特性区别较大。胚胎和新生小鼠心脏组织的研究结果不能完全代表成年心脏组织的特性。Tbx18+心外膜参与成年小鼠心脏组织具体什么结构的形成，以及来源于Tbx18+心外膜的成年心脏组织是否具有心系细胞特性，还需要进一步验证。
　　目的：揭示Tbx18+心外膜对成年小鼠心脏组织不同结构形成的影响，并验证来源于Tbx18+心外膜的成年心脏组织是否具有心系细胞特性；进一步判定多少成年小鼠心脏组织来源于Tbx18+EPCs。
　　方法：整体和组织切片X-gal染色检测成年心脏组织LacZ的表达；免疫荧光双标鉴定来源于Tbx18+心外膜的成年心脏组织特性；FACS法分离Tbx18-Cre/Rosa26EYFP成年小鼠EYFP+细胞。
　　结果：成年Tbx18-Cre/Rosa26LacZ/EYFP小鼠心脏LacZ/EYFP表达于心脏的心室肌、心房肌、冠状动脉、室间隔、瓣膜；LacZ/EYFP阳性组织同时可表达肌钙蛋白cTNT；三只成年Tbx18-Cre/Rosa26EYFP心脏组织细胞用FACS分离，分选的EYFP+细胞比例数值分别为：31.07％、34.77％、35.98％，平均33.94％。
　　结论：成年小鼠心脏的心室肌、心房肌、冠状动脉、室间隔、瓣膜等心肌组织均可来源于Tbx18+EPCs；约1/3的成年心脏组织细胞来源于Tbx18+EPCs，Tbx18+EPCs参与成年小鼠心脏组织的部分形成。