内源性大麻素系统参与尼古丁预处理对局灶性脑缺血损伤的神经保护效应

流行病学研究发现吸烟人群阿尔茨海默病(Alzhemer’s disease,AD)和帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)的发病率较低。近年来的一些细胞及动物实验研究发现,尼古丁可以对抗N-甲基D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)介导的细胞毒性作用,可以延缓神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)剥夺所引起的P12细胞死亡,可以对抗甲基苯丙胺引起的多巴胺能神经元变性,提高纹状体内多巴胺的含量,改善自发性运动行为。这些研究提示烟草中的尼古丁可能具有神经保护效应。此外,大麻素受体拮抗剂可以对抗长期摄取尼古丁后的行为学改变,尼古丁长期作用于机体可以引起脑中内源性大麻素含量升高。提示尼古丁与内源性大麻素系统具有交互作用。已有证据表明内源性大麻素系统的激活在神经缺血损伤等过程中具有保护作用,因此,我们推测尼古丁预处理可能通过影响内源性大麻素系统起到神经保护作用。
　　本研究采用大鼠大脑中动脉阻闭(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型,研究尼古丁预处理能否对大鼠局灶性缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤起到保护作用,并探讨其可能机制,为临床应用药物预处理的方式提供新的理论依据。本研究由四个实验组成:
　　一、尼古丁预处理对大鼠局灶性I/R损伤的保护作用;
　　二、CB1受体拮抗剂AM251减弱尼古丁预处理的神经保护作用;
　　三、给予尼古丁后脑内大麻素(2-AG、AEA)的含量变化;
　　四、给予尼古丁后脑内大麻素受体(CB1)的变化。
　　实验一尼古丁预处理对大鼠局灶I/R损伤的保护作用
　　方法:30只雄性SD大鼠,体重280-320g,随机分为3组(n=10):MCAO组;Nicotine+MCAO组:在MCAO前2h以1.2mg/kg经腹腔注射尼古丁酒石酸盐溶液;TA+MCAO组:在MCAO前2h以0.4mg/kg经腹腔注射酒石酸溶液。各组动物以线栓法行大脑中动脉阻闭2h,再灌注后24h后采用Garcia法进行神经行为学评分,评分后断头取脑,取脑组织冠状切片行TTC染色,以测量脑梗死容积百分比。
　　结果:与MCAO组相比Nicotine+MCAO组动物的神经行为学评分明显升高(P＜0.05),梗死容积百分比明显降低(P＜0.05)。MCAO组和TA+MCAO组间无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:尼古丁预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用。
　　实验二CB1受体拮抗剂AM251减弱尼古丁预处理的神经保护作用
　　方法:40只雄性SD大鼠(280-320g),随机分为5组(n=8):MCAO组;Nicotine+MCAO组:在MCAO前2h以1.2mg/kg经腹腔注射尼古丁酒石酸盐溶液;AM251+Nicotine+MCAO组:尼古丁酒石酸盐溶液注射前30min以10mg/kg经腹腔注射AM251;Vehicle(溶剂,AM251溶于其中)+Nicotine+MCAO组:给与尼古丁酒石酸盐溶液前30min经腹腔注射溶剂;AM251+MCAO组:MCAO前2.5h以10mg/kg经腹腔注射AM251。各组动物以线栓法行大脑中动脉阻闭2h再灌注24h后,采用Garcia神经行为评分及脑梗死容积百分比评定预处理效果。
　　结果:与Nicotine+MCAO组相比,AM251+Nicotine+MCAO组的神经行为学评分明显降低(P＜0.05),脑梗死容积百分比升高(P＜0.05)。Nicotine+MCAO组和Vehicle+Nicotine+MCAO组间无统计学差异(P＞0.05)。与MCAO组相比,AM251+Nicotine+MCAO组的神经行为学评分较高(P＜0.05),脑梗死容积百分比较低(P＜0.05)。MCAO组和AM251+MCAO组间亦无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:大麻素受体拮抗剂AM251可以部分逆转尼古丁预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。
　　实验三给予尼古丁后脑中内源大麻素(2-AG、AEA)的含量变化
　　方法:54只雄性SD大鼠(280-320g),随机分为9组(n=6):Sham组,0.5h TA组,0.5h Nicotine组,1h TA组,1h Nicotine组,2h TA组,2h Nicotine组,3h Nicotine组,3h TA组。各组动物在腹腔注射后的指定时间断头取右侧脑组织,以液相色谱-质谱联用分析方法观察内源性大麻素2-AG及AEA的含量变化。
　　结果:与Sham组相比,腹腔注射尼古丁酒石酸盐溶液0.5h后脑中内源性大麻素(2-AG和AEA)含量未见明显变化;1h后内源性大麻素含量明显增加;2h后内源性大麻素含量达到高峰;3h后内源性大麻素含量下降基础水平。而TA组中内源性大麻素含量在各时间点与Sham组相比没有统计学差异。
　　结论:尼古丁可以引起大鼠脑中内源性大麻素(2-AG和AEA)含量增加。
　　实验四给予尼古丁后脑中内源大麻素受体(CB1)的变化
　　方法:56只雄性SD大鼠(280-320g),随机分为7组(n=8):Sham组,2h TA组,2h Nicotine组,4h TA组,4h Nicotine组,6h TA组,6h Nicotine组。各组动物在腹腔注射后的指定时间点断头取脑,以Western Blot方法分析脑内源性大麻素受体CB1的含量。另取9只雄性SD大鼠(280-320g),随机分为3组(n=3):Sham组,6h TA组,6h Nicotine组,在药物注射6h后,按我科以前报道的方法在麻醉状态下经心脏灌注含4％多聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液,制作脑组织冠状切片(10μm),行CB1受体免疫荧光染色。
　　结果:脑内源性大麻素受体CB1在尼古丁酒石酸盐溶液注射后6h升高(P＜0.05),其余各组之间无统计学差异(P＞0.05)。免疫组化结果显示Sham组及6h TA组内仅观察到少量CB1受体,6h Nicotine组在可观察到较多的CB1受体表达。
　　结论:尼古丁可以促使大鼠脑中内源性大麻素受体(CB1)上调。
　　小结:1.尼古丁预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。
　　2.大麻素受体拮抗剂AM251可以部分逆转尼古丁预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。
　　3.尼古丁可以引起大鼠脑中内源性大麻素(2-AG和AEA)含量增加。
　　4.尼古丁可以促使大鼠脑中内源性大麻素受体(CB1)上调。