昆白小鼠体细胞核移植

自1998年首例体细胞克隆小鼠成功后，克隆小鼠不仅在数量和品系上不断增多，而且供核细胞种类和也在增加。昆白小鼠体细胞克隆未见成功报道，昆白小鼠是我国自主繁殖的近交系小鼠，由于遗传背景清楚、生殖周期短、环境适应能力强等优点，是国内良好的实验动物模型。昆白小鼠的体细胞克隆不仅对克隆机理研究，而且对遗传学、胚胎学和分子生物学等领域都有重要的意义。　　本研究从4个方面对昆白小鼠体细胞核移植进行了研究：供体细胞的采集、Spindle-view对卵母细胞的去核效率的影响，活力检测和核型分析，不同注核方法对克隆效率的影响。1.通过对分离培养的1-6代的供核细胞进行核型分析和活力测定，各代间核型正常，细胞活力无显著性差异(P＞0.05)，证明用1-6代的细胞作为供核细胞是可行的。2.Spindle-view协助的卵母细胞去核。分别用Spindle-view协助和盲吸法对注射hCG后10和12h的小鼠卵母细胞去核，用Spindle-view协助的去核率分别为95﹪和87﹪，用盲吸法为90﹪和22﹪。因此用Spindle-view协助下对hCG后10h卵的去核不仅去核率高，而且对卵母细胞损伤小。3.培养液和激活方法的筛选。用正常胚胎筛选培养液，CZB和M16克服2细胞阻滞的比率分别为76.9﹪、56.2﹪，经检验发现差异显著(P＜0.05)，胚胎其他发育阶段虽无显著性差异(P＞0.05)，但CZB比M16稍高，因此选用CZB培养重组胚。分别用电刺激，酒精，SrCl2和钙离子载体4种不同的激活方法对卵母细胞的激活，激活率分别为40.8﹪、90.1﹪、60.3﹪、88.4﹪，发现用酒精和SrCl2激活效果较好，两组发育到桑椹胚的比率分别为16.4﹪和3.6﹪，经比较酒精激活比SrCl2激活效果好(P＜0.05)。4.不同注核方法对克隆效率的影响。用卵周隙注射和卵胞质注射两种方法注核发现用电融合方法融合率34.8﹪，有13枚重构胚卵裂，其中3枚发育到3-4cell，1枚发育到6-cell，卵胞质注射成功率8.2﹪，激活培养后没有卵裂的。因此卵周隙注射优于卵胞质注射。