青藤碱对RANKL和LPS诱导的破骨细胞的影响及作用机制研究

骨代谢的稳定需要破骨细胞(OCs)介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成作用间的动态平衡和偶联，在健康个体中，二者维持功能平衡，而平衡一旦打破则可能导致骨骼疾病的发生。骨破坏主要是由异常的OCs活化造成的，过度骨破坏可能导致一些常见疾病，如类风湿关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎等。目前对于这些疾病的药物治疗相当有限，主要依赖于糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素或非甾体抗炎药，然而这些药物不能逆转骨质侵蚀，有的甚至有反作用。OCs是体内唯一负责骨吸收的细胞，靶向抑制OCs活化被认为是逆转骨破坏最有效、最直接的治疗策略，目前已经成为该领域的研究热点。
　　 OCs起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞，在体内必须依赖于一些诱因诱导分化发育为多核的成熟OCs。目前认为最直接活化OCs的内源性分子是激活核因子NF-κB受体的配体(RANKL)。RANKL通过和OCs膜上受体RANK结合，募集形成TRAF6和c-Src复合体，激活下游信号通路(NF-κB、MAPK和Ca2+通路)通过胞内信号传导途径激活核转录因子NF-κB、AP-1和NFATc(l)，激活OCs相关基因表达，例如抗酒石酸碱性磷酸酶(TRACP)，金属基质蛋白酶9(MMP-9)，整合素β3（integrinβ3）和组织蛋白酶K(cathepsinK)，促进OCs分化，增强骨吸收活性，抑制其凋亡，最终导致OCs数量增多、功能亢进。
　　 脂多糖(LPS)被认为是导致慢性G-菌感染骨丢失的最主要介质，被认为与诱导OCs活化密切相关，其诱导机制目前认为包括:通过诱导成骨细胞中RANKL的表达来控制OCs的分化和激活;通过刺激巨噬细胞产生TNF-α，IL-1和IL-6等炎症因子以及延长OCs的生命周期。
　　 青藤碱是传统抗风湿中药青风藤中的主要活性成分。具有明显抗风湿、抗炎、免疫抑制等药理作用。其相关制剂在临床上对各种风湿病具有确切疗效。尽管相关研究发现青藤碱具有降低骨破坏程度的效果，但是否能调控OCs仍未见有报道。本课题以青藤碱为研究对象，利用体外RANKL和LPS诱导OCs体系及体内Mt诱导的佐剂性关节炎骨破坏模型和LPS诱导的急性颅骨骨破坏模型，探讨青藤碱对OCs的调节作用及分子机制。主要内容包括三部分:1.青藤碱对RANKL诱导的OCs的影响;2.青藤碱对RANKL诱导的OCs的作用机制;3.青藤碱对LPS诱导的RAW-OCL的影响及机制。
　　 实验方法:
　　 1)通过CellTiter-Glo法和CCK-8法考察不同浓度青藤碱(0.125、0.25、0.5、1mM)干预不同时间(6h、24h、48h、5d)对RAW264.7细胞的生存影响，确定合适的体外用药浓度。利用体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成OCs体系，通过TRACP染色计数评价青藤碱(0.25、0.5、1mM)对OCs形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价青藤碱(0.5、1mM)3天内对成熟OCs骨吸收功能的影响;利用标记FITC的鬼笔环肽染色评价青藤碱(1mM)6h内对OCs肌动蛋白环结构的影响;采用Real-Time PCR技术，检测青藤碱(0.25、0.5、1 mM)对RANKL诱导的RAW264.7细胞相关基因TRACP，MMP-9，c-Src，Integrinβ3和cathepsin K表达水平的影响。
　　 建立Mt诱导的佐剂性关节炎SD大鼠骨破坏模型，评价青藤碱(i.p.80mg/kg/day)和阳性药物雷公藤多甙片(i.g.2.5 mg/kg/day)对模型动物足踝肿胀、骨破坏病理变化、OCs数量、骨参数（组织矿物质密度、骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量，骨小梁分离度）及血清中相关细胞因子RANKL、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、TRACP5b和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)水平的影响。
　　 2)考察青藤碱对RANKL相关信号通路的影响，利用体外RANKL诱导RAW264.7细胞体系中，首先采用荧光报告基因技术，检测青藤碱对核转录因子NF-κB活化的影响;接着通过Western blot和免疫荧光实验，检测青藤碱对NF-κB信号通路相关分子(p65和IκB-α)表达及p65核转位的影响;再通过RT-PCR和Western blot检测青藤碱对NF-κB上游分子（RANK和TRAF6）表达的影响。接下来通过Western blot和Ca2+探针Fluo-3 AM标记考察了青藤碱对TRAF6下游MAPK信号通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s内RANKL诱导OCs的Ca2+浓度变化。最后通过荧光报告基因技术检测青藤碱对核转录因子AP-1和NFAT活化的影响;再通过RT-PCR和Western blot检测青藤碱对AP-1相关分子（c-Fos、Fra-1和Fra-2）和NFATc(l)基因表达及c-Fos蛋白表达的调控。
　　 考察青藤碱对RANKL诱导的成熟OCs凋亡的影响，首先通过DNA Ladder分析不同浓度(0.25、0.5、1、2mM)青藤碱在不同时间段(12、24、36、48 h)对OCs凋亡的影响;再通过Hochst33258染色评价0.5mM青藤碱在单用或联合Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO(10μM)时对OCs细胞核凋亡的影响。对于青藤碱诱导成熟OCs凋亡的信号通路，我们通过Western blot和检测不同浓度(0.25、0.5、1、2mM)青藤碱在不同时间段(12、24、36、48 h)对活化的Caspase-3蛋白表达的影响，并利用Caspase-3酶活性比色法检测0.5和1mM青藤碱以及阳性对照药物喜树碱（4μM）在单用或联合Ac-DEVD-CHO(10μM)24h内对Caspase-3酶活性的影响。
　　 3)利用体外LPS诱导RAW264.7细胞形成RAW-OCLs体系，通过TRACP染色计数评价青藤碱(0.25、0.5、1mM)对RAW-OCLs形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷计数评价青藤碱（0.25、0.5、1mM）对3天内对成熟RAW-OCLs骨吸收功能的影响;利用标记FITC的鬼笔环肽染色评价青藤碱(1mM)6h内对RAW-OCLs肌动蛋白环结构的影响;利用ELISA检测青藤碱(0.25、0.5、1 mM) LPS诱导的RAW-OCLs释放TNF-α的影响;采用Real-TimePCR技术，检测青藤碱(0.25、0.5、1mM)对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的TRACP, MMP-9，c-Src，Integrinβ3和cathepsin K基因表达影响。建立LPS诱导的C57BL/c小鼠急性颅骨骨破坏模型，通过HE染色和TRACP染色评价青藤碱(i.h.25、50、100 mg/kg/day)对LPS诱导的颅骨破坏和OCs数量的影响，并通过ELISA检测血清中TNF-α水平。
　　 考察青藤碱对LSP诱导的RAW-OCLs作用机制，首先采用荧光报告基因技术，检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子NF-κB活化的影响;接着通过Western blot和免疫荧光实验，检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关分子（p65和IκB-α）表达及p65核转位的影响;再通过RT-PCR检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的NF-κB上游分子（TLR4和TRAF6）表达的影响，最后利用和Western blot检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和TRAF6蛋白表达的影响。接下来通过Western blot和Ca2+探针Fluo-3 AM标记考察了青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞的MAPK信号通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s内RAW-OCLs的Ca2+浓度变化。最后通过荧光报告基因技术检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子AP-1和NFAT活化的影响;再通过RT-PCR检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的AP-1相关分子（c-Fos、Fra-1和Fra-2）和NFATc(l)基因表达的调控并利用Western blot检测RAW264.7细胞中c-Fos蛋白表达水平。
　　 实验结果:
　　 1)细胞生存实验发现除1mM青藤碱干预5d后（抑制率约50％，F=10.95，P＜0.01），青藤碱(0-1mM)对RAW264.7细胞5天内生存未发现显著影响。通过TRACP染色发现0.25mM、0.5mM和1 mM青藤碱能显著抑制体外RANKL诱导的OCs形成(F=65.08，P＜0.01)，0.5 mM和1mM青藤碱能显著抑制OCs生存(F=91.08，P＜0.01);通过骨片吸收实验发现0.5 mM和1mM青藤碱3d内能显著降低骨吸收面积(F=59.35，P＜0.01)和骨凹陷(F=24.79，P＜0.01)，提示其抑制成熟OCs骨吸收功能。1mM青藤碱6h内能破坏OCs的肌动蛋白环结构，显著减少肌动蛋白环数量(t=8.628，P=0.0132)。青藤碱能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的TRACP(F=35.99, P＜0.01),MMP-9(F=63.30, P＜0.01),c-Src(F=21.80, P＜0.01),Integrinβ3(F=6.839，P=0.0134)和cathepsin K(F=5.052，P=0.0298)基因表达，尤其对c-Src，MMP-9，TRACP的表达在0.25 mM时仍具有显著性差异。80mg/kg/day青藤碱阻断Mt诱导的关节炎大鼠足肿胀发展，降低关节滑膜部位的炎症侵润并显著降低OCs数量(F=16.61，P＜0.01)，提高骨密度，显著升高骨参数TMD(F=12.34, P＜0.01)、BMD(F=7.066, P＜0.01)、BV/TV(F=13.22,P＜0.01)、Tb.Th(F=18.69, P＜0.01)、Tb.N(F=16.67, P＜0.01)，降低Tb.Sp(F=40.26,P＜0.01)，显著降低血清中RANKL含量(F=33.58，P＜0.01)，RANKL/OPG比值(F=12.81，P＜0.01)和TRACP酶活力(F=9.789，P＜0.01)，升高OPG含量(F=13.07，P＜0.01)和ALP酶活性(F=38.66，P＜0.01)。
　　 2)机制研究发现，青藤碱剂量依赖性抑制RANKL诱导的NF-κB报告基因表达，0.25 mM时仍具有显著性差异(F=107.9，P＜0.01)。青藤碱通过抑制IκB-α降解和p65入核表达从而抑制RANKL诱导NF-κB信号通路活化，并显著抑制其上游分子TRAF6基因(F=32.82，P＜0.01)和蛋白表达。青藤碱选择性抑制RANKL诱导的TRAF6下游分子JNK和p38磷酸化及OCs的Ca2+内流。青藤碱剂量依赖性抑制RANKL诱导的NFAT(F=93.23，P＜0.01)和AP-1(F=25.70，P＜0.01)报告基因表达，0.25 mM时仍具有显著性差异。0.5和1mM青藤碱均能显著抑制AP-1相关分子c-Fos(F=14.96，P＜0.01)、Fra-1(F=36.00，P＜0.01)、Fra-2(F=12.71，P＜0.01)和NFATc(l)(F=10.82，P＜0.01)基因表达并抑制c-Fos蛋白表达。
　　 0.5mM青藤碱干预12-48 h和0.25-2 mM青藤碱干预24h均导致RANKL诱导的成熟OCs出现DNA梯状条带，其中以0.5 mM作用24 h最为显著;通过Hochst33258染色也发现0.5 mM青藤碱干预24h后导致大量OCs细胞核出现典型断裂，聚集和浓缩，该现象部分被Ac-DEVD-CHO阻断，提示青藤碱通过激活Caspase-3诱导OCs凋亡。通过Western blot试验发现0.5 mM青藤碱干预成熟OCs12-48 h均能诱导活化的Caspase-3亚基表达上升，0.5-2mM青藤碱干预24 h均能诱导活化的Caspase-3亚基表达上升。同时通过比色法发现0.5 mM和1mM青藤碱均能显著提高OCs的Caspase-3酶活力(F=54.26，P＜0.01)，但能被Ac-DEVD-CHO完全阻断。
　　 3)通过TRACP染色发现0.5 mM和1mM青藤碱能显著抑制体外LPS诱导的RAW-OCLs形成(F=41.29，P＜0.01)和生存(F=53.74，P＜0.01)。通过骨片吸收实验发现0.5 mM和1mM青藤碱3d内能显著RAW-OCLs形成的骨凹陷数量(F=37.01，P＜0.01)，提示其对于LPS诱导的OCLs的骨吸收活性有抑制作用。1mM青藤碱6h内能显著降低LPS诱导的RAW-OCLs的肌动蛋白环结构百分率(t=12.73，P＜0.01)。0.25-1 mM青藤碱能呈剂量依赖性显著降低LPS诱导的TNF-α释放(F=38.08，P＜0.01)。1mM青藤碱对LPS诱导的RAW264.7前体细胞的TRACP,(F=20.97, P＜0.01)、MMP-9(F=29.99, P＜0.01)、c-Src(F=21.83,P＜0.01)、Integrinβ3(F=5.363, P=0.0256)和cathepsin K(F=13.13, P＜0.01)均具有显著抑制作用;0.5mM时除Integrinβ3外，也均具有显著抑制作用;0.25mM时对c-Src、cathepsin K和MMP-9仍具有显著抑制作用。对成熟OCLs各相关基因表达，0.5mM和1mM青藤碱对TRACP,(F=418.6，P＜0.01)、MMP-9(F=61.85, P＜0.01)、c-Src(F=387.0, P＜0.01)、Integrinβ3(F=176.9, P＜0.01)和cathepsin K(F=166.0，P＜0.01)均具有显著抑制作用，尤其对TRACP、c-Src和MMP-9的表达在低浓度(0.25 mM)时仍具有显著抑制效应。通过组织学图像分析，100和50 mg/kg青藤碱能显著降低LPS诱导的小鼠颅骨骨破坏模型的炎症侵润面积(F=32.97，P＜0.01)和TRACP+细胞数量(F=31.48，P＜0.01)，并且25，50，100 mg/kg青藤碱均能显著降低血清中TNF-α含量(F=31.18，P＜0.01)。
　　 机制研究发现，青藤碱剂量依赖性抑制LPS诱导的NF-κB报告基因表达，0.25mM时仍具有显著性差异(F=150.5，P＜0.01)。青藤碱通过抑制RAW264.7细胞IκB-α降解和p65入核表达从而抑制LPS诱导NF-κB信号通路活化，并呈剂量依赖性抑制其上游分子TLR4(F=9.551，P＜0.01)和TRAF6(F=71.64，P＜0.01)基因和蛋白表达;而对于RAW-OCLs仅抑制TLR4(F=60.60，P＜0.01)的基因表达而未发现影响TRAF6。青藤碱选择性抑制LPS诱导RAW264.7细胞的MAPK通路中p38和ERK磷酸化，并抑制RAW-OCLs的Ca2+内流，提示其可能影响下游转录因子AP-1和NFATc(l)。进一步研究发现青藤碱在0.25-1 mM浓度下显著抑制LPS诱导的NFAT报告基因表达(F=98.74，P＜0.01);0.5和1mM时能显著抑制AP-1报告基因表达(F=181.5，P＜0.01)。RT-PCR实验发现0.5和1mM青藤碱均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中AP-1相关分子c-Fos(F=72.34, P＜0.01)、Fra-1(F=28.28, P＜0.01)、Fra-2(F=33.08, P＜0.01)和NFATcl(F=39.98，P＜0.01)基因表达;在RAW-OCLs中0.25-1mM青藤碱对c-Fos(F=685.1, P＜0.01)、Fra-2(F=3015, P＜0.01)和NFATc(l)(F=3033, P＜0.01)表达均具有显著抑制作用，但对Fra-1未发现显著抑制作用。青藤碱呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中c-Fos蛋白表达。
　　 结论:
　　 1.青藤碱能抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成OCs，并抑制其骨吸收功能。
　　 2.青藤碱通过激活Caspase-3诱导OCs凋亡和破坏OCs的肌动蛋白环结构，从而抑制OCs生存。
　　 3.青藤碱能抑制Mt诱导的关节炎大鼠OCs活化，降低骨破坏，提高骨密度。
　　 4.青藤碱通过抑制上游TRAF6，一方面调控NF-κB信号通路抑制核转录因子NF-κB活化;另一方面通过抑制JNK和p38磷酸化和Ca2+内流，抑制核转录因子AP-1和NFATcl;最终下调OCs相关基因表达，抑制RANKL诱导的OCs活化。
　　 5.青藤碱能抑制体外LPS诱导的RAW-OCLs形成、生存和骨吸收功能。
　　 6.青藤碱能抑制LPS诱导的小鼠急性颅骨骨破坏模型的OCs活化并降低TNF-α水平。
　　 7.青藤碱通过调控上游TLR4和TRAF6，影响NF-κB、MAPK信号通路和Ca2+内流，抑制核转录因子NF-κB、AP-1和NF ATc1，下调OCs相关基因表达，降低TNF-α释放，最终抑制LPS诱导的OCLs活化。