开菲尔(Kefir)粒中菌种的分离鉴定及优良菌株的复合发酵乳研究

开菲尔（kefir）是一种发泡型含有少量酒精的发酵乳制品，是最受欢迎的发酵乳之一，它起源于历史悠久的世界第一长寿地区高加索。开菲尔拥有多种益生功能，它不仅可以改善肠胃系统，增强人的免疫力，还具有一定的抑制癌细胞等生理性能。随着国民生活水平的提高，人们对日常饮食与健康的重视，现有的菌种构相简单的发酵乳已无法满足消费者对市场的要求。因此，从国内外不同地区及不同来源的菌种丰富的开菲尔粒中筛选具有优良发酵性能的菌株，进而制备多种益生菌混合的发酵乳已成为了研究的热点。
　　目前，开菲尔大多由开菲尔粒发酵牛、羊乳而制成，而开菲尔粒又是一种天然多菌种复合发酵剂，易受环境和来源影响。在开菲尔的工业化生产过程中，开菲尔粒直接作为发酵剂时，存在着菌种组成复杂、易变性、未知性等缺点都严重阻碍了开菲尔的工业化生产的进程。而纯培养菌种发酵剂可以完美地解决这些问题，它具有很多优点：操作方便、菌相结构明晰、菌种组成固定、可控性强、能直接应用于工业化生产。
　　为了研制新型风味酸乳复合发酵剂，本实验首先对开菲尔粒增殖培养的工艺条件进行优化研究，以期为后续的菌种鉴定和发酵剂制备提供稳定的菌种来源。实验中对不同地区和来源开菲尔粒进行了菌种的分离纯化鉴定，为新型风味发酵剂的制备提供了丰富的菌种选择。然后，将品质优良的开菲尔粒共生乳酸菌进行了发酵剂复配，以期得到口感稳定、风味宜人的发酵乳。最终希望能将其应用到工业生产中，生产出具备丰富益生效果的发酵乳，为工业化生产奠定基础。
　　本文的主要研究内容和结论如下：
　　1、菌种鉴定和发酵剂的研制需要大量的开菲尔粒作为支撑，开菲尔粒的增殖培养是开菲尔研究的基础。实验首先对开菲尔粒的增殖培养条件进行了优化，优化结果为：脱脂乳为最优的培养基类型，40％的脱脂乳粉的培养基对开菲尔粒的增殖效果最佳，额外添加碳源、氮源和无机盐对开菲尔粒的增殖并没有明显的效果，且一定程度上阻碍了其正常生长。综合经济因素，本实验选用20％的脱脂乳为初始培养基。研究结果表明，当选择不清洗、较小粒径增殖效果较好。单因素实验结果显示，开菲尔粒的增殖率随着温度、转速、时间、接种量、pH的增大增加，而达到一定程度时，会随着水平的上升而下降。响应面优化结果为：选择培养温度为30.4℃，接种量为2.12％，摇床转速为99 r/min。验证结果显示，在此培养条件下，开菲尔粒的平均生长速率为14.68％，比初始培养条件提高了32.01％。
　　2、开发优良发酵剂配方，品质优良的菌株是关键。因此，本实验对不同来源的6种开菲尔粒进行分离纯化鉴定，共得到55株菌，其中，从开菲尔粒N中分离得到12株菌，分别为3株单孢酿酒酵母菌（Kazachstania unispora），1株kudriavzevii毕赤酵母菌（Pichia kudriavzevii），1株异型德克酵母（Dekkera anomala），2株肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），2株开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri），1株热带醋杆菌（Acetobacter tropicalis），1株syzygii醋杆菌（Acetobacter syzygii），1株cibinongensis醋酸菌（Acetobacter cibinongensis）；开菲尔粒X中分离纯化得到10株菌,分别为2株单孢酿酒酵母菌（Kazachstania unispora），1株k udriavzev ii毕赤酵母（Pichia k udriavzev ii），1株马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），1株肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），3株开菲尔乳杆菌（ Lactobacillus kefiri），1株罗旺醋杆菌（ Acetobacter lovaniensis），1株蒲桃醋杆菌（Acetobacter syzygii）；开菲尔粒SK中分离得到7株菌，分别为1株单孢酿酒酵母酵母（Kazachstania unispora），1株kudriavzevii毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），4株开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri），1株蒲桃醋杆菌（Acetobacter syzygii）；开菲尔粒SX中分离得到13株菌，分别为1株马克思克鲁维酵母（ Kluyveromyces marxianus），1株单孢酿酒酵母酵母（Kazachstania unispora），1株occidentalis毕赤酵母（Pichia occidentalis），1株假丝酵母（Candida stellimalicola），5株开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri），1株罗旺醋杆菌（ Acetobacter lovaniensis），2株冲绳醋杆菌（ Acetobacter okinawensis），1株蒲桃醋杆菌（Acetobacter syzygii）；开菲尔粒 TX分离得到6株菌，分别为1株马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），4株开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri），1株蒲桃醋杆菌（Acetobacter syzygii）；开菲尔粒FX分离得到7株菌，分别为1株马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），1株kudriavzevii毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），4株开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri），1株芝比农醋酸菌（Acetobacter cibinongensis）。
　　3、其中，分离得到的Acetobacter cibinongensis，Dekkera anomala，Candida stellimalicola在开菲尔粒研究中未见有相关报道。
　　4、开菲尔风味发酵乳不仅要求具备爽口的滋味，而且拥有丰富的益生功能，所以，本实验通过筛选复配，研制出了具有较佳开菲尔风味的乳酸菌复合发酵乳。首先，对6种开菲尔粒进行筛选，结果表明：6种开菲尔粒中，开菲尔X风味最佳，感官评定分数最高，达到89分。而且，挥发性成分分析结果显示，开菲尔粒X中的呈香物质乙偶姻含量较高，与感官评定结果吻合。通过开菲尔X的涂布计数结果，模拟出一个发酵乳纯培养发酵剂配方，取对数期中段的开菲尔菌种Leuconostoc mesenteroides xr-1，L. kefiri xr-2，L. kefiri xr-3，L. kefiri xr-4，菌量添加量之间的比例为5:1:2:3。复配发酵乳风味和口感极好，发酵时间很短。与开菲尔 X的风味相似，且营养指标测定结果表明，复配乳具有很高的营养价值，说明配方成功。