中国柑橘黑斑病相关的叶点霉属真菌种类、遗传多样性和快速诊断技术研究

柑橘黑斑病(Citrus Black Spot，CBS)，也称黑星病，病原的有性态为柑橘球座菌(Guignardia citricarpa Kiely)，属子囊菌门，座囊菌目;无性态为柑橘叶点霉菌(Phyllosticta citricarpa(McAlpine) van der Aa)，属半知菌类，腔孢纲，球壳孢目。病菌主要危害果实，在果皮上形成病斑导致鲜果的商品性下降，甚至无法上市鲜售。CBS病菌被欧盟列为A1类严禁入境的有害生物，也是美国严禁入境的有害生物，因此是包括我国在内有黑斑病发生国家柑橘鲜果出口的重要障碍。尽管我国是柑橘的原产地之一，栽培柑橘种类繁多，黑斑病发生普遍，但对不同类型柑橘的黑斑病菌病原种类是否一致，以及病菌的生物学特性和分子变异并无研究。
　　 本研究从我国柑橘主产区几大栽培柑橘上收集黑斑病或疑似黑斑病症状的果实和叶片，分离培养获得代表性菌株若干，在此基础上开展这些代表性菌株的种类鉴定、种内遗传多样性分析，以及种特异性引物的筛选和相关的PCR鉴定体系的建立。主要研究结果如下:
　　 1.建立了P.citriasiana的分子鉴定技术在ITS1区域设计了针对于亚洲柑橘叶点霉菌P.citriasiana的特异性上游引物Pca8，结合下游引物ITS4，建立了准确、灵敏和快速鉴定P.citriasiana的PCR体系。利用该体系可从P.citriasiana菌株中扩增出488 bp的特异性条带，而不能从柑橘叶点霉菌P.citricarpa和首都叶点霉菌P.capitalensis(一种内生菌)，以及其他柑橘常发病害病原菌中扩增出条带。该体系检测P.citriasiana DNA最低为12 pg，整个过程可在3小时内完成。
　　 2.明确了中国柑橘上叶点霉属真菌种类自2007-2011年，从我国10个省市的宽皮橘(Citrus reticulata)、柚(C.maxima)、葡萄柚(C paradisi)、甜橙(C.sinensis)以及柠檬(C.limon)等具典型或非典型黑斑病症状的果实和叶片上分离获得496个Phyllosticta菌株。通过形态学比较，可将这些菌株分为4类。选择74个代表性菌株，克隆测定其18S rDNA和28S rDNA的部分区域、核糖体DNA的两个转录间隔区及其中的5.8S亚基(internal transcribed spacer，ITS)、肌动蛋白(Actin，ACT)，延长因子(translation elongation factor-1 alpha，TEF1)，B微管蛋白(B-tubulin，Tub)和钙调蛋白(calmodulin，Cal)基因的部分序列，单独或合并后构建系统进化树，结果发现这74个菌株分为4个明显的分支。其一为P.citricarpa，即被欧盟和美国列为检疫对象的柑橘叶点霉菌。该病菌的寄主有宽皮橘、甜橙和柠檬，但没有从柚上发现;其二为P.citriasiana，引起柚黑斑病（也被称为棕褐斑病，“tan spot”），寄主为沙田柚和琯溪蜜柚，但未从其他柑橘种上发现;其三是P.capitalensis，即一种内生菌，可从本研究中的各种柑橘的有症或无症材料上获得;其四是一个有别于已有的Phyllosticta spp.，本文暂时将之定为Phyllostictacitrichinaensis X.H.Wang，K.D.Hyde&H.Y.Li。该菌可从本研究中的各种柑橘的非典型黑斑病症状的材料上获得。
　　 在这4个Phyllosticta spp.中，P.citrichinaensis的分生孢子最小，附属丝最长，短杆状孢子和子囊孢子最大;P.citrichinaensis在PDA，CMA和MEA培养基表面形成具有多个环形凹槽的菌落，在OA培养基上不产生黄色素;当以葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖分别作为唯一碳源时，P.citrichinaensis生长较差，菌落直径小于其他三种Phyllosticta;当以尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、胰蛋白胨、脯氨酸、甘氨酸分别作为唯一氮源时，P.citrichinaensis生长最差，菌落直径均小于其他三个Phyllosticta种，且P.citrichinaensis几乎不能利用尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、 NH4NO3;P.citrichinaensis生长pH范围为3.0-6.0，最适为4.0，其次为3.0。在pH为3.0-5.0的PDA培养基上，P.citrichinaensis比P.citriasiana和P.citricarpa生长快，但比P.capitalensis生长慢。
　　 3.建立巢式多重PCR鉴定柑橘上四种叶点霉属真菌的技术体系比较4种叶点霉属真菌的ITS1及18S区域序列，设计并筛选了针对P.citrichinaensis、P.citricarpa、P.capitalensis和P.citriasiana特异性上游引物Pcc1、Pc1、Pct4和Pca8(见1)，并均以通用引物ITS4作为下游引物。以已知该4种菌的菌株DNA作为对照，首先使用ITS4/ITS5对供试菌株进行第一轮扩增，PCR产物稀释50-100倍后，同时加入引物对Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pca8/ITS4，在退火温度为60℃条件下进行第二轮PCR扩增，通过扩增条带与已知种菌株的相应扩增条带大小的比较，确定待测样品所属的叶点霉属菌的种类。该体系的灵敏度达到2 ag的DNA。与传统PCR相比其灵敏度至少提高106倍。不仅可用于试验室培养的待测菌株的鉴定，还可以用于果实疑似黑斑病的病斑快速鉴定。
　　 4.明确了中国柑橘叶点霉属真菌遗传多样性通过对影响PCR反应的主要成分模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶及引物等条件的优化，建立了适合柑橘叶点霉菌的ISSR-PCR反应体系。利用该体系从100条引物中筛选出11条扩增条带稳定、清晰、重复性好和多态性高的引物。利用筛选的11条引物和优化的ISSR-PCR体系，对供试的110个来自柑橘的叶点霉属菌株进行扩增，共扩增出197个条带，多态性条带为194个，多态率为98.5％，证明中国柑橘上叶点霉属真菌遗传多样性丰富。利用NTSYS-pc2.10软件对扩增的条带进行分析并构建UPGMA聚类图，显示中国柑橘叶点霉属真菌可以分为四个分支，每分支对应着P.citricarpa，P.citriasiana，P.capitalensis和P.citrichinaensis。P.citricarpa的遗传分化与寄主种类相关，而与地理来源无关。来自甜橙和柠檬的菌株与来自宽皮柑橘的菌株分布在不同的分支中，而来自砂糖橘的菌株又聚为一个分支。而P.citriasiana，P.capitalensis和P.citrichinaensis种群内的遗传变异与地理距离和寄主均无相关性。