激活TRPV1上调UCP2防治糖脂代谢紊乱致动脉粥样病变的机制研究

背景和目的:
　　动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)仍然是心源性猝死和脑血管意外等致残、致死疾病的主要病因。目前的治疗手段,如药物、介入手术和外科干预并不能有效地遏止我国心脑血管病的高发趋势。多项研究显示某些膳食因子如DASH(Dietary Approachto Stop Hypertension)饮食,地中海(Mediterranean)饮食,Prudent饮食等可有效地降低心脑血管病的发病率和病死率。我国流行病学调查研究结果表明,我国南方地区冠心病的发病率和死亡率均显著低于北方,该现象除了跟北方地区气候因素及人群盐的摄入量要显著高于南方以外,还可能跟南方,尤其是西南地区人群膳食喜辣的生活方式有密切的联系。辣椒素是辣椒中辣味的主要成分,其作用靶点是辣椒素受体,亦称瞬时受体电位通道香草醛亚家族1(Transient Receptor potential vanilloid1,TRPV1),当辣椒素与TRPV1结合后可促进细胞内Ca2+浓度的增加,从而介导一系列的病理生理反应。前期研究表明,膳食辣椒素通过激活TRPV1具有显著的心血管代谢保护作用:激活血管内皮细胞上的TRPV1受体可增加细胞内Ca2+的浓度,通过cAMP/PKA/eNOS信号通路从而促进一氧化氮(NitricOxide,NO)的释放,改善血管内皮依赖性舒张功能,降低自发性高血压大鼠(Spontanously Hypertensive Rats,SHR)的血压;激活脂肪细胞上的TRPV1可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化成熟,防止脂质的形成,从而具有防治肥胖的作用。课题组成员近期研究还发现,膳食辣椒素可通过激活血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)上的TRPV1受体,减少VSMCs对脂质的摄取,防止VSMCs泡沫化并减少脂质在ApoE敲除小鼠血管的沉积;膳食辣椒素还可防止高盐环境对血管功能的氧化应激性损害从而导致的血压升高,该研究提示激活TRPV1具有显著的对抗氧化应激导致的血管功能损害。脂质代谢紊乱,长期的慢性炎症和机体内氧化应激水平的升高是AS发生、发展的重要机制。前期研究揭示了激活TRPV1对脂质代谢的调节作用从而防治AS斑块形成的机制,但关于激活TRPV1对AS病理状态下氧化应激导致的心血管损害的影响及机制值得进一步深入研究。
　　在心血管危险因素如血脂异常,血糖升高的影响下,活性氧(Reactiveoxidespecies,ROS)产生增加,使血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)脱偶联,经精氨酸途径生成的NO与超氧阴离子结合生成具有极强破坏力的硝基化产物,进一步破坏细胞结构和相关的酶系,还可使血管平滑肌NO/cGMP信号通路功能下降从而导致动脉粥样硬化相关的血管功能损害。近年发现,存在于线粒体膜上的解偶联蛋白2(uncouplingprotein2,UCP2)通过介导质子漏降低线粒体膜电位,使呼吸链氧化磷酸化解偶联,具有调节能量代谢和ROS生成的作用。UCP2敲除小鼠由于体内抗氧化能力下降,在高脂饮食的诱导下血管内可产生显著的AS斑块。另一方面,既往研究提示膳食辣椒素可通过激活肝脏细胞中的TRPV1上调UCP2的表达,从而具有防治非酒精性脂肪肝的作用。为此,在本研究中我们提出如下理论假设,膳食辣椒素通过激活血管内皮细胞TRPV1可上调UCP2蛋白的表达,从而减少由于糖脂代谢紊乱导致的ROS生成增加,改善心血管系统的结构与功能。本研究的开展将进一步阐明TRPV1在动脉粥样硬化血管的结构与功能损害过程中的重要作用,为AS相关的血管功能障碍的防治提供新的干预靶点,并为膳食因子干预AS尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病提供实验依据。
　　材料与方法:
　　ApoE敲除(ApolipoproteinE,ApoE-/-)小鼠是目前公认的研究AS较为理想的模型,ApoE-/-小鼠能自发形成高脂血症和AS。db/db小鼠是瘦素受体缺陷型小鼠,具有高胰岛素血症,胰岛素抵抗和血糖升高等类似人类2型糖尿病的特征,是目前研究2型糖尿病及相关的血管损伤的重要动物模型。为证实我们的研究假设,在考察辣椒素对脂质代谢紊乱致动脉粥样病变血管损伤影响的实验研究中,我们利用已有的TRPV1-/-,ApoE-/-(C57BL/6J背景)和UCP2-/-(C57BL/6J背景)小鼠杂交培育出双基因敲除小鼠ApoE-/-/TRPV1-/-,ApoE-/-/UCP2-/-结合ApoE-/-小鼠和相应的野生型(Wildtype,WT)小鼠开展相关的实验研究。而在考察辣椒素对糖代谢紊乱致血管损伤影响的实验研究中我们则利用TRPV1-/-(C57BL/6J背景)及相应的野生型小鼠,db/db(C57BL/KsJ背景)及相应的野生型小鼠开展相关的研究。
　　1.首先观察膳食辣椒素对AS小鼠冠脉功能和形态的作用。(1)采用微血管张力测定仪分析长期膳食辣椒素对AS小鼠冠状动脉血管功能的影响。雄性8周龄ApoE-/-,ApoE-/-/TRPV1-/-,ApoE-/-/UCP2-/-小鼠给予普通饮食,高脂饮食和高脂+辣椒素(含0.01％辣椒素)干预24周后取冠状动脉观察血管对辣椒素诱导的血管舒张功能变化,乙酰胆碱诱导的血管内皮依赖性舒张功能,硝酸甘油诱导的血管非内皮依赖性舒张功能变化的影响。(2)H&E染色,油红O染色和Masson染色观察长期膳食辣椒素对冠状动脉狭窄程度的影响。(3)利用生物电放大器观察小鼠体表心电图的改变及辣椒素的干预作用;以异丙肾上腺素腹腔注射负荷后利用动态心电技术观察缺血性ST段改变的情况以评估膳食辣椒素干预后小鼠的抗心肌缺血的能力。
　　2.观察膳食辣椒素对AS小鼠心脏重构和功能以及远期生存的影响。(1)利用小动物超声技术观察膳食辣椒素干预后高脂喂养的AS小鼠心脏的结构与功能的改变,观察的主要指标包括心脏室间隔的厚度,收缩功能,舒张功能,主动脉血流速度,冠脉血流速度等。(2)观察长期膳食辣椒素对小鼠远期生存的影响,并描绘生存曲线,计算小鼠平均生存时间。
　　3.观察激活TRPV1防治脂质紊乱致动脉粥样血管损害的机制。(1)利用氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)干预血管内皮细胞,观察辣椒素对ROS生成水平的影响,免疫印迹法(Westernblotting)观察辣椒素对UCP2,PKA的调节作用;(2)Westernblotting观察长期膳食辣椒素对AS小鼠主动脉组织TRPV1,eNOS,p-eNOS,PKA,p-PKA,UCP2,Nitrotyrosine等分子表达的影响。(3)荧光染色和westernblotting观察长期膳食辣椒素对小鼠血管组织ROS,NO和硝基化水平的影响。
　　4.膳食辣椒素对糖代谢紊乱及相关血管损害的影响及机制。(1)利用动态血糖技术观察膳食辣椒素对TRPV1-/-和相应的野生型小鼠血糖水平的影响;(2)观察膳食辣椒素对db/db小鼠体重、血糖、血压和血管功能的影响;(3)H&E染色及荧光染色观察膳食辣椒素对db/db小鼠胰岛的形态与功能的影响;(4)Westernblotting观察长期膳食辣椒素对db/db小鼠主动脉组织TRPV1,eNOS,p-eNOS,PKA,p-PKA,UCP2和P22phox等分子的表达水平的影响;(5)分别利用DHE与DAF-2DA荧光探针染色观察血管组织中ROS及NO水平。
　　结果:
　　1.膳食辣椒素对AS小鼠冠脉功能和形态的影响:(1)高脂饮食使AS小鼠辣椒素诱导的血管舒张功能和乙酰胆碱诱导的血管内皮依赖性舒张功能显著减退,膳食辣椒素可有效地防止高脂饮食导致的ApoE-/-小鼠冠脉对辣椒素和乙酰胆碱诱导的血管舒张的减退,但对硝酸甘油诱导的非内皮依赖性舒张反应无显著的作用;膳食辣椒素对高脂饮食诱导的ApoE-/-/TRPV1-/-和ApoE-/-/UCP2-/-小鼠辣椒素诱导的舒张反应,乙酰胆碱和硝酸甘油诱导的舒张反应无显著影响。(2)长期膳食辣椒素可显著减轻高脂喂养ApoE-/-小鼠的冠状动脉狭窄程度。(3)体表心电图和动态心电图结果显示,高脂饮食使AS小鼠出现显著的ST段压低,而长期膳食辣椒素可显著改善ApoE-/-小鼠ST段压低情况,增强ApoE-/-小鼠对抗异丙肾上腺素诱导的心肌缺血能力;膳食辣椒素对ApoE-/-/TRPV1-/-,ApoE-/-/UCP2-/-的ST段压低和异丙肾上腺素的负荷后的心肌缺血无显著的改善作用。
　　2.膳食辣椒素对AS小鼠心脏结构和功能的影响以及远期生存的观察结果:(1)高脂饮食使AS小鼠心脏增大、左心室重量、心脏/体重比值增加;(2)超声结果提示,膳食辣椒素可显著防止高脂饮食导致的ApoE-/-小鼠的左心室重构,改善左室的舒张功能,但对收缩功能无显著的影响。(3)长期膳食辣椒素可显著延长高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠的生存时间,对ApoE-/-/TRPV1-/-,ApoE-/-/UCP2-/-小鼠的生存时间无显著影响。
　　3.TRPV1/PKA/UCP2通路在防治脂质代谢紊乱致动脉粥样病变中的作用:(1)辣椒素和eNOS的抑制剂(L-NAME,100μM)可显著对抗ox-LDL导致的血管内皮细胞ROS水平的上升,而TRPV1阻断剂、PKA拮抗剂和UCP2的抑制剂可显著减弱辣椒素的作用。(2)Westernblotting结果提示辣椒素可呈浓度依赖性的上调UCP2的表达,并可被TRPV1和PKA的拮抗剂所拮抗。(3)长期膳食辣椒素显著上调高脂喂养ApoE-/-小鼠主动脉组织中TRPV1,p-PKA,UCP2,p-eNOS的表达水平,降低硝基酪氨酸水平;DHE染色表明膳食辣椒素还可显著降低ApoE-/-小鼠血管内膜超氧阴离子水平,增加NO的水平;膳食辣椒素对ApoE-/-/TRPV1-/-,ApoE-/-/UCP2-/-小鼠血管组织中TRPV1,p-PKA,UCP2,p-eNOS和硝基酪氨酸的表达水平,血管内膜的超氧阴离子和NO水平无显著的影响。
　　4.膳食辣椒素对糖代谢紊乱及相关的血管损害的作用:(1)膳食辣椒素可显著降低WT小鼠空腹血糖水平,改善糖耐量,降低24h平均动态血糖水平,但对TRPV1-/-小鼠的血糖水平无显著的影响。14周膳食辣椒素的干预可显著降低db/db小鼠的体重和空腹血糖,改善小鼠对胰岛素的敏感性,改善胰岛形态与功能。(2)膳食辣椒素可显著改善db/db小鼠的乙酰胆碱诱导的血管内皮功能依赖性舒张功能,但对硝酸甘油诱导的非内皮依赖性舒张功能无显著的影响;(3)Westernblotting提示与相应的WT小鼠比较,TRPV1,p-PKA在db/db小鼠的主动脉和肠系膜动脉组织中的表达显著下降,NADPH-P22phox,UCP2的表达上调,而膳食辣椒素可修复db/db小鼠血管组织中TRPV1,p-PKA的表达,增加p-eNOS,UCP2的水平降低NADPH-P22phox的水平。
　　结论:
　　1.辣椒素激活TRPV1通过上调血管内皮细胞中PKA/UCP2信号通路,可显著减少ox-LDL导致的血管内皮细胞ROS水平的升高。
　　2.膳食辣椒素通过激活TRPV1以UCP2依赖的方式显著防止高脂饮食导致的AS小鼠冠脉功能的减退,从而减轻冠脉的狭窄程度,防止心肌重构和舒张功能的减退,并最终延长AS小鼠的生存时间,其机制涉及长期膳食辣椒素通过激活TRPV1上调PKA/UCP2信号通路，从而显著降低血管组织中超氧阴离子和硝基酪氨酸的水平，增加血管内皮NO的水平。
　　3.膳食辣椒素通过激活TRPV1改善葡萄糖代谢紊乱及相关的血管功能损害，其机制与辣椒素可修复TRPV1与p-PKA在糖代谢紊乱血管中的表达，上调UCP2的功能降低P22ph0X的活性有关。
　　4.膳食辣椒素通过激活TRPV1显著改善糖脂代谢紊乱致动脉粥样病变，其机制涉及激活TRPV1可上调血管内皮细胞中的PKA/UCP2通路，从而减少ROS的生成，增加NO的水平。