脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血淋巴细胞的遗传毒性研究

霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒有害的二级代谢产物。在土壤中、植物上、谷物、饲草和青贮饲料等均可发现霉菌毒素。霉菌毒素可在农作物收获时形成。在不适宜的贮存条件下,霉菌毒素也可继续在收获后的农作物上形成。世界上每年大约有25％谷物遭受各种霉菌污染,因污染程度不同,不同地区差距很大,而中国是霉菌毒素污染的重灾区之一。
　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称呕吐毒素,它能够对人体健康造成极大的伤害。它主要是由镰刀菌的某些种菌产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物——单端孢霉烯族化合物中的一种。DON的主要产生菌是禾谷镰刀菌,据报道也有其它一些镰刀菌可产生。DON属于剧毒类,以往的研究中表明:DON在体内可能有一定的蓄积,且具有很强的细胞毒性,但无特殊的靶器官。人畜误食了被DON污染的食物/饲料后,会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状,严重时会损害造血系统造成死亡。
　　目前,在食品安全和基础毒理学研究(致畸)中也发现,DON能够在很多的食品中以极低的含量检测出。如大、小麦制品可检出1ppm的DON含量、4月龄鸡肉中可检测出10ppm的DON含量,猪肉中可检出5ppm的DON含量以及酒类中均能检测出DON的存在。毒理学研究指出:100ng/mL的DON能导致细胞分裂指数下降、细胞炎性物质过度表达和细胞出现凋亡的情况。低剂量的DON能造成V79细胞出现微核及染色体畸变;经口灌服(1000mg/kg)能致使胎鼠和仔鸡的骨骼畸形和小鼠生殖细胞数量下降以及细胞形态发生畸形。综上所述,不同剂量的DON能致使动物脏器和细胞受到不同程度的损伤,特别是生殖细胞的数量和活力的下降,这也提示了,DON可能具有潜在的细胞毒性和遗传毒性。然而,迄今为止,文献中关于DON对人原代细胞是否有遗传毒性和其毒性的分子毒理学的研究还比较少。
　　因此,本研究的目的在于:利用人外周血淋巴细胞作为实验对象,观察DON对人原代细胞的细胞毒性和遗传毒性。并利用分子生物学技术对细胞毒性和遗传毒性进行分子层面的研究。
　　第一部分脱氧雪腐镰刀菌烯醇导致人外周血淋巴细胞的遗传毒性研究
　　目的:以人外周血淋巴细胞为研究对象,观察DON对人淋巴细胞的细胞活力抑制作用(IC50)、对人淋巴细胞DNA的损伤作用,以及对人淋巴细胞染色体损伤的作用。方法:(1)志愿者均为健康人员,血样采集前需经过知情同意书的填写和个人健康状况的询问,包括:是否在近期接受过药物治疗、是否有遗传病和传染病以及是否有不良嗜好(抽烟或酗酒)等。(2)全血样本用淋巴细胞分离液分离提取淋巴细胞,随后用PRMI1640培养液重悬,并接种于细胞培养板。(3)利用CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)试剂盒检测细胞活力,并计算IC50数值。(4)利用单细胞凝胶电泳法,检测DON对淋巴细胞 DNA的损伤程度。(5)在微核试验中利用细胞松弛素-B阻滞法检测DON暴露下的淋巴细胞微核的产生情况。(6)利用姐妹染色体交换法,观察DON造成人淋巴细胞染色体损伤的程度。结果:(1)在染毒DON24h后,细胞活力从98.07±0.10％(0ng/mLDON)下降到14.03±1.78％(500ng/mLDON)(P<0.01)。两性细胞样本的IC50为:男---103.7±2.83ng/mL;女---101.4±3.15ng/mL,男性样本和女性样本的IC50之间无性别差异(P>0.05)。(2)在染毒24h后,与阴性对照组相比,DON组的Tail length、Tail DNA％和Tail moment的数值明显增加(P<0.01)。(3)微核试验的结果显示,DON的暴露能明显增加人淋巴细胞中微核的数量。染毒组微核数量明显高于阴性对照组(23.86±4.11‰,0ng/mL DONvs109.66±9.81‰,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。(4)姐妹染色体交换的结果表明,与阴性对照组相比,DON暴露24 h后能明显的破坏染色体结构,使染色体缺失或畸形的数量明显上升(62±13.01/30cells,0ng/mL DONvs206.17±18.40/30cells,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。结论:(1)DON的暴露能明显抑制人淋巴细胞的细胞活力。提示DON具有潜在的细胞毒性。(2)人淋巴细胞暴露于DON环境中,细胞的DNA损伤程度、微核数量以及染色体损伤数量明显增加。提示DON具有潜在的遗传毒性特征。
　　第二部分脱氧雪腐镰刀菌烯醇导致人外周血淋巴细胞氧化应激的机制研究
　　目的:以人外周血淋巴细胞为研究对象,探讨DON造成的氧化应激与DNA损伤和染色体损伤之间的关系。方法:(1)人群血样采集与细胞提取过程和培养方法参照第一部分。(2)利用高效液相色谱法对DON导致人外周血淋巴细胞脂质过氧化的产物进行定性及定量分析。(3)利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用法对GSH含量及GSSG的含量进行定量和定性分析。(4)利用荧光探针法(DCFH-DA)装载细胞培养基,对细胞中ROS的含量进行定量分析,并利用激光共聚焦显微镜对细胞内ROS进行荧光定性分析。(5)利用Annexin V-FITC探针法装载细胞后,在流式细胞仪中对膜损伤情况进行定量分析。(6)利用ELISA法检测DNA氧化性损伤标志物(8-OHdG)在人淋巴细胞中的含量,对DNA损伤进行初步的评估。结果:(1)人外周血淋巴细胞染毒DON后(24h),与阴性对照组相比,DON组的MDA的含量明显上升。(2)人外周血淋巴细胞染毒DON后(24h),与阴性对照组相比,DON组中GSH的含量明显下降,GSSG的含量随之升高。(3)人外周血淋巴细胞染毒DON后(24h),与阴性对照组相比,ROS荧光探针的荧光强度随时间-剂量而增强。并且在激光共聚焦显微镜成像图中,可以观察到细胞内荧光强度增强,细胞形态由正常形态逐渐变的固缩及变形,细胞膜逐渐失去光泽并呈现出不规则表面。(4)在DON暴露24h后,FITC探针与细胞膜磷脂结构的结合强度明显增强。(5)DON暴露24h后,染毒组8-OHdG的含量明显高于阴性对照组。结论:(1)DON能造成氧自由基的增多削弱抗氧化酶的活力,致使细胞内(膜)的过氧化加剧。(2)细胞坏死的数量和细胞膜变形,可能与DON造成的氧自由基增高有关。(3)由于DON使8-OHdG的含量明显上升,提示DON导致人淋巴细胞的细胞毒性和遗传毒性与DON导致DNA氧化性损伤有关。
　　第三部分脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血淋巴细胞遗传毒性的分子毒理学机制
　　目的:以人淋巴细胞染毒DON为体外模型,利用分子生物学技术进一步探讨DON对人淋巴细胞遗传毒性的分子毒理学机制。方法:(1)人群血样采样和细胞培养方法均与第一部分相同。(2)利用RT-PCR法,测定人淋巴细胞在染毒DON6、12和24h后的DNA修复相关基因的mRNA的表达水平。(3)利用Western-Blot法检测碱基切除修复关键基因hOGG1和XRCC1的蛋白表达水平。(4)利用Western-Blot法检测HO-1的蛋白表达水平。结果:(1)RT-PCR的结果显示,DNA修复相关基因和HO-1均在6h时表达明显高于阴性对照组(P<0.01),并在染毒12h时,出现下降的趋势(P<0.05)。在24h时,与阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。(2)Western-Blot的结果提示,与阴性对照组相比,碱基切除修复机制中的关键基因hOGG-1和XRCC1的蛋白表达水平在短时间内明显升高(P<0.01)。而在12h时,hOGG-1的蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05),XRCC-1却没有显著性差异(P>0.05)。在24h时,hOGG-1和XRCC1的蛋白表达水平均与阴性对照组无明显差异(P>0.05)。(3)Western-Blot的结果表明,染毒6、12和24h后,与阴性对照组相比,HO-1的蛋白表达水平在6h时明显升高(P<0.05)。但在染毒12和24小时后,没有显著性差异(P>0.05)。结论:(1)结果提示,DON能够在短时间内刺激DNA修复能力的提升,但DON浓度的增加和染毒时间的延长会抑制DNA修复能力。(2)Western-Blot的结果表明hOGG-1、HO-1和XRCC-1在6h时,有表达上调的现象。而在12和24h时,与阴性对照组相比较无明显差异。HO-1的表达抑制可能与DNA修复能力下降有关。
　　本研究的创新之处：
　　(1)本研究验证了DON能够对人外周血淋巴细胞造成遗传毒性。(2)本研究从DNA损伤/修复和氧化应激两方面探讨DON遗传毒性的分子毒理学机制,进而证明氧化应激与DON的遗传毒性有关。(3)DON可能通过抑制HO-1的表达,造成淋巴细胞内高氧化应激状态而导致DNA损伤。进而证明HO-1可能是DON导致人外周血淋巴遗传毒性的分子靶点。