弓形虫Chinese 1基因型虫株诱导巨噬细胞偏移应答的研究

目的：研究中国流行的优势基因型弓形虫Chinese1型虫株TgCtwh3与type I型RH株在诱导小鼠巨噬细胞偏移/极化能力上的差异性,并分析其可能存在的机制。
　　方法：(1)RH、TgCtwh3速殖子的复苏、传代:RH、TgCtwh3速殖子由本实验室保种,复苏后按每只106速殖子腹腔接种约6-8周龄的BALB/C小鼠;接种后密切观察,待小鼠出现明显活动减少、弓背、竖毛等症状时,脱颈处死小鼠。置于75％酒精中约5min后,将其四肢固定于蜡板,用消毒过的剪刀、镊子打开小鼠腹腔,注入无菌生理盐水冲洗腹腔再进行收集,并对腹水中的速殖子进行计数后待用;待传代3次后,弓形虫活力已经完全稳定时,可进行下一步实验;(2)虫株毒力实验:将40只 BALB/C小鼠分2组,每组分别腹腔接种101、102、103和104个TgCtwh3和RH速殖子,同样剂量同时注射接种5只小鼠,观察记录小鼠的发病和死亡时间;(3)提取TgCtwh3速殖子的总RNA并按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA,设计引物进行TgCtwh3的棒状体蛋白ROP16 PCR扩增,酶切鉴定后送生工测序;(4)RAW264.7细胞的培养和传代;按弓形虫:细胞为3:1的比例并分别感染TgCtWh3和RH虫株速殖子,待培养24小时后先收集上清液再按照试剂盒要求分别收取细胞的总蛋白、细胞核蛋白及提取细胞的总RNA;(5)对收集的标本分别进行蛋白印迹检测 M1/M2偏移相关转录因子和细胞因子stat3、pstat3、stat6、pstat6、iNOS、Arg-1、NF-κB和IκBα;荧光定量PCR检测IL-10、IL-12p40、iNOS、Arg-1等mRNA水平;收集的上清的进行NO的检测。
　　结果：(1)研究结果发现,Chinese1基因型弓形虫TgCtwh3株的ROP16的氨基酸序列与RH株在503位点处是相同的,均为亮氨酸(L503);(2)TgCtwh3株的虫株毒力稍弱于type I型的RH株;(3)TgCtwh3株和RH株感染RAW264.7细胞24h后,前者高表达iNOS和Arg-1;而后者高表达Arg-1;TgCtwh3株诱导巨噬细胞产生的NO浓度稍高于正常组和RH株感染组;(4)TgCtwh3株和RH株感染RAW264.7细胞24h后,细胞均高表达IL-12,低表达IL-10。
　　结论：(1)TgCtwh3株与 RH株在对巨噬细胞的诱导活化上存在差异,TgCtwh3株同时高表达iNOS和Arg-1,在表达程度上更倾向于iNOS,而RH株仅高表达Arg-1;(2)在作用RAW264.7细胞24小时后,TgCtwh3株和RH株均处在先天性保护性免疫状态(M1),高表达IL-12,低表达IL-10。