人源DNA损伤修复蛋白PTIP和裂殖酵母tRNA甲基转移酶Trm10的结构与功能研究

本论文前两章介绍了人源DNA损伤反应相关蛋白PTIP的结构与功能研究。DNA损伤应答是对于维持基因组的稳定性所必不可少的细胞内基本的过程，该过程对于细胞和有机体的功能的发挥至关重要。在细胞周期的不同时期，一旦DNA被内源性或外源性的一些因子损伤，许多蛋白都能被招募到DNA损伤位点，这些蛋白在这里可以组成一个复杂的相互作用网络进而激活DNA损伤修复系统。在哺乳动物细胞中的DNA损伤修复途径中，组蛋白变异体H2AX的C-末端磷酸化是最早发生的染色质修饰，同时也是DNA修复过程中一个重要的早期事件，其目的在于招募DNA损伤修复蛋白到DNA双链断裂位点(DSBs)。值得一提的是，在包含串联BRCT结构域（BRCA1-C-末端结构域）的蛋白中，例如hMDC1，hMCPH1，spBrc1和spCrb2(53BP1在裂殖酵母菌属中的同源物)，BRCT结构域与H2AX(γH2AX)或磷酸化的H2A(在酵母中为γH2A)结合。
　　本论文开展了人源PTIP蛋白的结构生物学研究，PTIP蛋白包括六个BRCT结构域:其中两个在氨基端，另外四个在羧基端。已有的研究表明PTIP的第二个BRCT结构域直接和PA1作用，同时它的C端四个BRCT结构域在电离辐射(IR)以后可以与γH2AX共定位形成foci现象。研究表明，通过定向的肽库筛选，PTIP BRCT5-BRCT6结构域可以和模式为pS/T-Q-V-F的磷酸化的小肽结合。人源γH2AX的C末端尾巴有一个相似的序列模式(pS-Q)，具有与BRCT5-BRCT6结构域结合的最佳小肽序列，人源PTIP的裂殖酵母同源物Brc1可通过其C-末端的串联BRCT结构域与γH2A相互作用，暗示人源PTIP也可能识别γH2AX。我们通过荧光偏振实验证明PTIP BRCT5-BRCT6结构域与γH2AX小肽在体外有很强的相互作用，进而我们解析了2.15埃的BRCT5-BRCT6与γH2AX小肽复合物的晶体结构。该结构表明PTIP BRCT5-BRCT6具有保守的结合磷酸化底物的残基，而且对pSer+3位也有一定的选择性。我们的研究结果阐明了人源PTIPBRCT5-BRCT6结构域识别γH2AX的分子基础。
　　本论文后两章节介绍了裂殖酵母tRNA甲基转移酶spTrm10的结构与功能研究。tRNA甲基化为tRNA发挥其生物学功能所必需，它不仅影响到蛋白翻译的效率，而且还与tRNA三维结构的正确折叠有直接的关系。到目前为止，在tRNA中共发现两个位点的m1G的甲基化:一个是m1G37，它是由古细菌和真核生物的Trm5和细菌中的TrmD催化完成。Trm5属于经典的RFM甲基转移酶家族，而TrmD属于SPOUT甲基转移酶家族。另外一位是tRNA鸟嘌呤第九位的N1甲基化(m1G)，被发现在真核生物和古细菌中广泛存在，它是由甲基转移酶中的Trm10家族催化完成。
　　Trm10家族与上述的Trm5家族和TrmD没有任何的序列同源性，为了研究Trm10的催化机制，在本论文报道了tRNA甲基转移酶spTrm10（裂殖酵母）单独以及它与甲基供体产物S-腺苷-高半胱氨酸（SAH）复合物的晶体结构。同时，我的合作者邵振华也解析了在酿酒酵母同源物scTrm10与SAH的复合物晶体结构。我们的晶体学研究表明裂殖酵母spTrm10家族的甲基转移酶结构域（催化结构域）呈现出典型的SPOUT折叠类型。另外，X-射线小角散射分析表明spTrm10在溶液中以单体形式存在，然而，SPOUT家族中其他的成员均是以同二聚体的形式发挥功能。我们也进行了tRNA甲基转移酶活性分析、等温滴定热量测定实验(ITC)、凝胶迁移阻滞实验以及突变分析等实验手段，我们揭示了裂殖酵母spTrm10甲基转移酶识别底物tRNA的机制。