阻断NLRP3炎症小体中CaepasE-1活化治疗小鼠急性胃溃疡的实验研究

研究背景:急性胃溃疡通常发生于过量吸烟饮酒、大量服用非甾体抗炎药物和严重应激损伤，包括烧伤、休克、外科手术和脓毒症等。急性胃溃疡主要表现为胃粘膜浅表且广泛的病变。胃溃疡并发上消化道出血具有较高的发病率和死亡率。目前，人们对于急性胃溃疡的发病机制研究仍然不清楚，在众多胃溃疡的诱发因素中，高炎症状态被认为是引起急性胃溃疡和调节其严重程度的重要因素之一。Rozza AL等认为细胞因子TNF-a、IL-6和IL-10在急性胃溃疡过程中起着重要的调控作用。
　　炎症小体(Inflammasome)是多种蛋白聚合形成的复合体。作为固有免疫系统的重要组成部分，炎症小体对很多疾病的发生和发展起着重要的调节作用，其中包括痛风、肺损伤、糖尿病和登革热等疾病。NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)是目前研究最广泛深入的一种炎症小体，其主要包含识别蛋白NLP、衔接蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1。NLRP3炎症小体识别蛋白NLP接触并识别某些危险刺激后自身发生聚集活化和信号传导，进而引起效应蛋白Caspase-1活化，而后引起促炎性细胞因子IL-1β、IL-18的成熟和释放，Akosua等认为对炎症小体适当的调节可以有效调控促炎性细胞因子的释放。
　　本课题主要研究阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠急性胃溃疡损伤的保护作用及机制。鉴于Caspase-1蛋白是NLRP3炎症小体中最关键的蛋白之一，并且Caspase-1蛋白是一个关键的促炎性细胞因子成熟和释放的调节因子，在机体受到各种应激刺激后起到重要的调节作用。因此，利用Caspase-1特异性阻断剂AC-YVAD-CMK来阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化，研究其对小鼠冷束缚应激性胃溃疡和酒精灌胃诱导小鼠急性胃溃疡的保护作用。本课题发现阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化能够明显减轻小鼠急性胃溃疡损伤，该保护作用主要是通过减轻急性胃溃疡早期的炎症反应和抑制胃粘膜细胞凋亡实现的，保护作用的机制与阻断NF-κB和P38 MAPK信号通路有关。
　　第一部分小鼠急性胃溃疡模型的制作和验证
　　研究目的:根据本实验研究目的，制作合适的小鼠急性胃溃疡模型并验证制作模型是否成功，为后续研究阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对小鼠急性胃溃疡保护作用及机制的研究提供研究基础。
　　研究方法:①小鼠冷束缚应激性胃溃疡模型的制作过程如下:实验前给小鼠禁食24小时，实验开始时将小鼠置于冷束缚装置中，使水浸没到小鼠剑突平面，水温控制在20℃左右，8小时后小鼠冷束缚应激性胃溃疡模型制作完成。②另外一种无水酒精灌胃诱发小鼠急性胃溃疡模型制作如下:实验前将小鼠禁食24小时，无水酒精通过灌胃的方法注入小鼠胃内，对照组小鼠给予同样剂量的PBS水灌胃。灌胃4小时后，酒精灌胃诱发小鼠急性胃溃疡模型制作完成。
　　研究结果:本实验室研制一种简易小鼠冷束缚应激性溃疡制作装置，该装置获得中国实用新型专利(专利号201420111867X)。在小鼠冷束缚应激性胃溃疡和酒精灌胃诱导小鼠急性胃溃疡模型中，受伤小鼠粘膜均有散在的多发出血点，H&E染色结果显示损伤组小鼠胃粘膜病理改变明显，并且组内未见明显差别。
　　研究结论:利用大体照片和H&E染色方法评估小鼠胃粘膜的组织病理变化，认为两种小鼠急性胃溃疡模型制作成功。
　　第二部分阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对小鼠急性胃溃疡的保护作用的研究
　　研究目的:研究阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对小鼠急性胃溃疡的保护作用。
　　研究方法:按照第一部分中介绍的方法制作两种小鼠急性胃溃疡模型，在两个模型实验中分别将24只小鼠随机分到4个组内:①对照组，②损伤组，③损伤+奥美拉唑组，④损伤+ AC-YVAD-CMK组。安慰剂、奥美拉唑或者AC-YVAD-CMK在小鼠伤前半小时给药。模型制作完成后，为进行相关的组织病理分析，采用大体拍照和H&E染色，并检测胃粘膜表面胃液PH值和胃溃疡指数。同时，还通过ELISA方法检测血清中细胞因子TNF-α和IL-6水平，利用免疫组化方法检测胃组织中巨噬细胞浸润情况，通过Western blot方法检测胃组织中IL-18和IL-1β的蛋白表达情况。为进一步了解阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对冷束缚诱导的小鼠急性胃溃疡模型中细胞凋亡的影响，还检测了凋亡相关指标，通过Western blot方法检测cleaved-Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表达情况，利用TUNEL染色的方法检测胃粘膜细胞凋亡情况。另外，为了进一步确认阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对小鼠急性胃溃疡的保护作用，又在酒精灌胃诱发小鼠急性胃溃疡模型中进行了大体解剖和H&E染色的相关检测。
　　研究结果:在阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化治疗小鼠冷束缚应激性胃溃疡的实验中，大体照片和H&E染色的结果显示AC-YVAD-CMK预处理小鼠的胃溃疡和胃粘膜出血程度明显轻于损伤组小鼠。为了进一步量化结果，本研究还对胃粘膜表面胃液PH值和胃溃疡指数进行了相关检测，发现冷束缚应激性胃溃疡损伤组小鼠的胃液PH值为3.33±0.82，奥美拉唑治疗组小鼠胃液PH值为4.83±0.75，该组小鼠胃液PH值明显高于损伤组小鼠水平，AC-YVAD-CMK治疗组小鼠胃液PH值为4.17±0.41，与损伤组小鼠相比没有明显统计学差异。同时本实验还发现，冷束缚应激性胃溃疡损伤组小鼠的胃溃疡指数为18.83±2.32，AC-YVAD-CMK治疗组小鼠胃溃疡指数降低为8.67±1.21，在AC-YVAD-CMK和噢美拉唑治疗的小鼠组间胃溃疡指数没有统计学差异。为研究阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化在小鼠急性胃溃疡早期的抗炎作用，本研究还发现冷束缚损伤后小鼠胃组织中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达明显升高，AC-YVAD-CMK治疗后两种促炎性细胞因子的表达明显降低，而奥美拉唑治疗组小鼠的IL-1β和IL-18的表达与损伤组小鼠未见明显统计学差异。为了进一步验证阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1活化对小鼠冷束缚应激性胃溃疡的保护作用，本实验采用免疫组化方法在胃组织中标记F4/80阳性细胞，观察胃组织中巨噬细胞浸润情况。实验发现小鼠冷束缚应激性损伤后胃组织中巨噬细胞浸润增加，AC-YVAD-CMK治疗组小鼠的胃组织中巨噬细胞浸润明显少于损伤组小鼠。ELISA检测发现AC-YVAD-CMK治疗组小鼠血清TNF-α和IL-6水平显著低于损伤组小鼠。为了进一步评估阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化对小鼠冷束缚应激性胃组织细胞凋亡的保护作用，本研究Western blot方法发现AC-YVAD-CMK治疗组小鼠cleaved-Caspase-3/Caspase-3水平明显低于损伤组小鼠。而且，Bax蛋白在损伤组和奥美拉唑治疗组小鼠胃组织中的表达均高于对照组小鼠水平，AC-YVAD-CMK治疗组小鼠Bax蛋白表达水平明显降低。TUNEL染色的实验结果显示损伤组小鼠的胃粘膜上皮可见明显的凋亡细胞，而AC-YVAD-CMK治疗组小鼠凋亡细胞明显减少。另外在阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化治疗酒精灌胃诱导小鼠急性胃溃疡的实验中，大体照片和H&E染色的结果显示AC-YVAD-CMK预处理的小鼠的胃溃疡和胃粘膜出血程度明显轻于损伤组小鼠。
　　研究结论:本实验证明阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化对小鼠冷束缚应激性胃溃疡和酒精灌胃诱发的小鼠急性胃溃疡均具有明显的保护作用，该保护作用与阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化早期的抗炎和抗凋亡作用密切相关。
　　第三部分阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化对小鼠急性胃溃疡保护作用的机制研究
　　研究目的:探讨阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化对小鼠急性胃溃疡保护作用的相关机制。
　　研究方法:考虑到MAPK/NF-κB信号通路活化在小鼠急性胃溃疡发病早期起着重要作用，为研究阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白活化对小鼠急性胃溃疡保护作用的相关机制，本实验通过Western blot方法对冷束缚应激性胃溃疡小鼠胃组织中P38、P-P38和P-IκB蛋白表达情况进行了检测。
　　研究结果:实验发现损伤组小鼠和损伤+奥美拉唑治疗组小鼠胃组织中P-P38/P38的水平明显高于对照组小鼠水平，而AC-YVAD-CMK治疗组P-P38/P38的水平明显低于损伤组和损伤+奥美拉唑治疗组。而且，实验发现损伤组和奥美拉唑组小鼠胃组织中P-IκB蛋白的表达明显高于对照组小鼠水平，AC-YVAD-CMK治疗组中P-IκB蛋白水平明显低于损伤组和奥美拉唑治疗组。
　　研究结论:本实验证明阻断NLRP3炎症小体中Caspase-1蛋白的活化对小鼠急性胃溃疡有明显的保护作用，其机制与降低MAPK/NF-κB信号通路活性有关。