β-葡聚糖通过抑制NFIA的表达调控G-MDSCs功能

目的:利用来源于酿酒酵母的颗粒性β-葡聚糖(wholeβ-glucan paticles，WGP)作用于小鼠粒细胞样髓源抑制性细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells，G-MDSCs)，检测G-MDSCs中核因子I-A(Nuclear Factor I-A，NFIA)表达情况，研究胞内相关信号分子的改变;体外通过RNAi技术抑制G-MDSCs中NFIA的表达，观察细胞免疫抑制功能的变化;观察经NFIA基因抑制的G-MDSCs对小鼠体内肿瘤生长的影响。
　　方法:
　　1.通过免疫磁珠分离技术分选出小鼠脾脏中G-MDSCs，采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测 G-MDSCs中NFIA mRNA的表达情况。
　　2.体外使用WGP刺激G-MDSCs，通过qRT-PCR和Western-blot检测G-MDSCs中NFIA的表达情况。
　　3.体外利用小鼠NFIA特异性siRNA抑制G-MDSCs中NFIA蛋白表达。随后采用比色法定量检测G-MDSCs中精氨酸酶1(Arginase-1，Argl)的活性，利用流式细胞术(FCM)检测G-MDSCs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的表达情况，利用[3H]TdR掺入试验检测G-MDSCs的免疫抑制功能。
　　4.①体外利用特异性抗Dectin-1抗体阻断β-葡聚糖受体Dectin-1后，再使用WGP作用于G-MDSCs，通过qRT-PCR和Western-blot分别检测阻断Dectin-1途径后G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表达情况;②体外采用WGP刺激G-MDSCs，通过Westem-blot检测Dectin-1下游信号分子c-jun的活化情况;③利用c-jun分子磷酸化抑制剂SP600125下调c-jun分子磷酸化水平，再使用WGP作用于G-MDSCs，通过qRT-PCR和Western-blot分别检测G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表达情况。
　　5.将转染NFIA特异性siRNA的G-MDSCs与Lewis肺癌细胞混合后皮下注射C57BL/6小鼠，连续监测肿瘤生长及小鼠生存率。
　　结果:
　　1.与野生型小鼠相比，从荷瘤小鼠脾脏分选出的G-MDSCs中NFIA mRNA表达水平升高44.0％(P＜0.05)。
　　2.通过qRT-PCR和Western-blot检测发现:WGP刺激48h后，G-MDSCs中NFIAmRNA表达水平下降88.2％(P＜0.001)，NFIA蛋白表达水平下降44.4％(P＜0.05)。
　　3.利用小鼠NFIA特异性siRNA抑制G-MDSCs中NFIA蛋白表达后，与对照组G-MDSCs中Arg1活性（6.339±0.5468 U/L）相比，siRNA处理组G-MDSCs中Arg1活性（3.482±0.3391 U/L）显著下调(P＜0.01，n=6); ROS的表达未出现明显变化;G-MDSCs免疫抑制功能实验表明，抑制G-MDSCs中NFIA表达可以下调G-MDSCs的免疫抑制功能(P＜0.05)。
　　4.①WGP可抑制G-MDSCs中NFIA的表达，阻断Dectin-1途径后再使用WGP作用于G-MDSCs，结果显示:WGP对G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白表达的抑制作用减弱(P＜0.05，P＜0.01);②Western-blot结果显示:WGP刺激30min后，G-MDSCs中Dectin-1下游信号分子c-jun的磷酸化水平显著升高(P＜0.001);③抑制c-jun分子磷酸化水平后再使用WGP作用于G-MDSCs，qRT-PCR和Western-blot结果显示:抑制c-jun分子磷酸化水平后，G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表达均恢复到较高水平(P＜0.01，P＜0.05)。
　　5.siNFIA组小鼠肿瘤体积在肿瘤植入后第19天、第21天和第23天均明显小于对照组小鼠。其中siNFIA组小鼠肿瘤体积在肿瘤植入后第19天为169.4±42.30 mm3、第21天为224.3±53.51 mm3、第23天为306.6±86.06 mm3，与此相对应的，对照组小鼠肿瘤体积在肿瘤植入后第19天为403.3±35.57 mm3、第21天为608.4±49.97mm3、第23天为956.4±70.22 mm3。结果表明siNFIA组小鼠肿瘤生长被有效延缓。同时还观察到，相对于对照组小鼠，siNFIA组小鼠生存率明显升高(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.WGP通过Dectin-1途径可促使G-MDSCs中c-jun分子磷酸化水平上调，抑制细胞内NFIA的表达，进而下调G-MDSCs的免疫抑制功能。
　　2.抑制G-MDSCs中NFIA的表达可有效延缓肿瘤生长。