68Ga标记NGR肽的肿瘤血管生成显像研究

背景:
　　正电子发射显像(Positron Emission Tomography,PET)已经成为核医学领域的主导成像方法之一。目前临床常用的正电子核素均依赖于回旋加速器生产,最常使用的18FDG并非肿瘤特异性靶向显像剂,进展中的抗肿瘤靶向治疗和个体化治疗准则对肿瘤特异性靶向显像剂提出了更高的要求。68Ge/68Ga发生器生产的正电子核素制备靶向特异性PET探针是对临床18FDG显像的重要补充。该发生器是发展最成熟的正电子发生器,68Ga的半衰期和正电子丰度特别适宜标记肽类等小分子物质用于PET显像。血管生成是抗癌治疗研究和肿瘤影像的非常有吸引力的靶点。APN/CD13在肿瘤血管生成中起到了重要作用,含有NGR基序的肽可以与肿瘤新生血管高表达的CD13特异靶向结合。构建靶向CD13的68Ga标记NGR肽,用有望用于CD13阳性的肿瘤血管生成显像并指导肿瘤抗血管生成靶向治疗。
　　目的:
　　1、以CD13为靶点,合成新的双功能螯合剂NOTA联接的NGR环肽单体和二聚体,并用68Ga标记,为靶向肿瘤血管生成的PET显像提供新的方法。通过肽结构设计,改善前期工作中存在的肝脏高摄取现象。
　　2、建立本实验室条件下68Ga标记肽的最优化条件和流程,为今后的标记工作和发展自动化标记奠定基础。
　　3、评估68Ga-NOTA-G3-NGR、68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2的体外性质,以及HT1080荷瘤鼠MicroPET显像效应及体内生物学分布。分别比较68Ga-NOTA-G3-NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2以及68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2两两之间的体外性质及 MicroPET显像效应的差异,为共表达CD13和整合素αvβ3的肿瘤靶向影像及靶向治疗的靶点和探针选择提供依据。
　　方法:
　　1、采用二硫键方式形成环化NGR肽;采用含有独立结合基团p-SCN-Bz的p-SCN-Bz-NOTA做为双功能螯合剂,有利于保留NOTA固有的结合空间和配位能力;选用G3修饰链增加两个CNGRC之间的键长,改善与受体结合能力及体内排泄动力;p-SCN-Bz-NOTA与NGR肽的联接采用稳定的硫脲键结合。
　　2、通过淋洗效率测定、确定分段淋洗法选取的淋洗区间。用分段淋洗法确定标记反应的最佳条件:pH、温度、反应时间和肽量,使用SCX柱和C18柱纯化标记产物,选取最佳纯化方法。在确立的最佳反应条件下用68Ga标记NGR肽和RGD肽,通过测定标记率和放化纯度,进一步确定反应条件的最优化。
　　3、测定所标记探针的脂水分配系数(logP)、体外稳定性、探针的细胞摄取和流出以及受体竞争抑制的IC50值,评断探针的体外性质。
　　4、标记探针对HT1080荷瘤鼠和HT29荷瘤鼠行MicroPET显像,并行未标记冷肽抑制实验,用ROI定量分析肿瘤和重要器官摄取情况,对比合成的NGR肽单体和二聚体之间、NGR肽二聚体和RGD肽二聚体之间的差异情况。并分别测定荷瘤鼠体内标记探针的生物分布情况一同进行比较。
　　结果:
　　1、经质谱分析证实成功合成了NOTA-G3-cCNGRC单体和二聚体。
　　2、用分段淋洗法确定了68Ga标记NOTA-G3-cCNGRC单体和二聚体的最佳反应条件为pH3.0-3.5,42℃,10 min,15-20μg肽。明确了对于68Ga标记肽的纯化即可采用C18柱,也可采用SCX柱。SCX柱洗脱效率高,稀释后可直接使用。C18柱纯化后含有乙醇,有时需做进一步处理。
　　3、68Ga-NOTA-G3-NGR、68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2均为亲水性探针,体外稳定性良好,体外实验显示良好受体结合特异性,三种探针均能使HT1080肿瘤清晰显像,肿瘤摄取能被未标记冷肽抑制,具备高靶向特异性和高的T/NT值。均经泌尿系统快速排泄,血液清除快,肝脏等重要器官摄取值低,有利于向临床应用转化。
　　4、PET定量分析及体内生物分布检测显示68Ga-NOTA-G3-NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2两种探针的肿瘤摄取及体内分布情况无显著差异;68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2两种探针的肿瘤摄取及体内分布情况无显著差异。
　　结论:
　　1、本研究成功合成了靶向CD13的NOTA联接的NGR环肽单体和二聚体。用分段淋洗发生器法确定了68Ga标记NOTA-G3-NGR的最适宜条件是pH3.0-3.5,42℃,10 min,15-20μg肽,确立了本实验室优化的68Ga标记肽的新方法。
　　2、新合成的68Ga-NOTA-G3-NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2都是适用于CD13阳性肿瘤血管生成显像的新型探针,也是目前报道的第一组68Ga标记NGR环肽探针。二者在HT1080肿瘤血管生成显像中具有同等效力,并且改变了前期工作中NGR肽探针的肝脏高摄取。
　　3、68Ga-NOTA-G3-RGD2和68Ga-NOTA-G3-NGR2对共表达CD13和αvβ3整合素的HT1080有相同的显像效力,为制备多靶点探针和鸡尾酒样的抗血管生成药物应用于人纤维肉瘤患者提供了依据。