间歇性低氧对肝细胞脂质代谢的影响及可能机制

研究背景与目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一类除酒精和其他明确因素影响，以肝细胞内脂质过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1-2]。近来有文献报道，睡眠呼吸暂停低通气综合征(sleepuapnea-hypopnea syndrome，SAHS)患者肝细胞内有异常的脂质沉积，认为慢性睡眠呼吸暂停综合征所致的间歇性低氧(intermenthypoxia，IH)可以诱发肝细胞脂质异常代谢[3]，目前有关间歇性低氧与肝细胞脂代谢之间的关系鲜见研究报道。活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)、低氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是调控哺乳动物适应低氧环境的重要因子，脂肪分化相关蛋白(adiposedifferentiation-related protein，adipophilin ADFP)、固醇调节原件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）-1c、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)是调节肝细胞脂肪酸转运和合成的关键分子。本实验拟用三气培养箱、人正常肝细胞(LO2)、肝癌细胞(HepG2)建立间歇性低氧细胞模型，探讨间歇性低氧对肝细胞脂代谢及相关分子的影响，旨在为治疗和预防NAFLD提供新的理论依据。
　　方法：
　　1、实验分组:对照组(21％ O2)、实验组（间歇性低氧组）
　　2、建立间歇性低氧细胞模型:在三气培养箱中用不同氧浓度(1％O2、2％O2、3％O2、21％O2)培养人肝LO2细胞和HepG2细胞持续8h/d，相继处理1、2、3、4、5、6d，显微镜下观察细胞形态变化，MTT方法检测细胞活力，甘油三酯试剂盒测定细胞内甘油三酯含量;油红O染色观察肝细胞脂质沉积情况。
　　3、western-blot方法检测HIF-1α、HIF-2α、ADFP、SREBP-1c、FAS在肝细胞内的表达。
　　4、活性氧检测试剂盒检测ROS在LO2、HepG2细胞内含量的变化。
　　结果：
　　第一部分间歇性低氧诱导肝细胞脂质异常沉积
　　1、低氧浓度的筛选:MTT方法检测1％O2、2％O2、3％O2、21％O2对HepG2、LO2细胞存活率的影响，结果示:经上述干预，1％O2条件下，6d后细胞存活率小于50％，2％O2、3％O2条件下6d后的细胞存活率约100％,根据相关参考文鲜[19，15]，选择2％O2、3％O2进行后续筛选。
　　2、间歇性低氧时间点筛选:甘油三酯试剂盒检测2％O2、3％O2对肝细胞内TG的影响，结果示:2％O2、3％O2低氧处理组随时间延长，各时间点细胞内TG含量逐渐增加，至第5d达高峰;相同对应时间点2％O2低氧组肝细胞内TG含量较3％O2低氧组明显升高(LO2:78.7±2.73vs56.2±1.73,t=13.92, p＜0.05; HepG2:96.4±3.67vs88.37±2.36，t=3.68，p＜0.05)，差异有统计学意义，因此选用2％O2为最佳低氧浓度，1、2、3、4、5d为低氧处理时间。
　　3、肝细胞内脂质检测
　　(1)随着时间的延长，对照组肝细胞TG含量无明显变化(FLO2=0.6，P=0.67＞0.05; FHepG2=0.82，P=0.53＞0.05)，经2％O2间歇性低氧干扰后，随着处理时间的延长TG含量逐渐增多，差异均有统计学意义(FLO2=61.83, P＜0.01; FHepG2=104.19, P＜0.01)。
　　(2)油红O染色:与对照组相比较，经间歇性低氧处理后LO2和HepG2细胞胞质内橘红色脂滴随时间延长增多并出现融合现象。
　　第二部分间歇性低氧对肝细胞脂质代谢影响的可能机制
　　1、肝细胞内HIF-1α、HIF-2α的蛋白表达变化
　　经2％O2持续干扰8h/d，分别依次处理1、2、3、4、5d后，HIF-1α、HIF-2α在第1d表达量较对照组明显增多(P＜0.05)，随着处理时间的延长HIF-1α的表达量逐渐增多(FLO2=371.19，FHepG2=150.84，P＜0.05)，HIF-2α的表达却逐渐下降，至低氧干预第4天低于对照组水平(tLO2=3.18, tHepG2=2.54, P＜0.05)。
　　2、 LO2和HepG2细胞中ROS的变化
　　实验组LO2和HepG2细胞内的ROS含量较对照组增多(tLO2=22.06，tHepG2=7.2，P＜0.05)并呈时间依赖性增多(FLO2=1021.84，FHepG2=49.89，P＜0.01)，差异有统计学意义。
　　3、肝细胞内SREBP-1c、FAS、ADFP分子的表达
　　与对照组比较，实验组第2d，SREBP-1c、FAS和ADFP蛋白表达开始升高(LO2:tSREBP-1c=5.83，tFAS=9.84，tADFP=19.99，P＜0.05;HepG2:tSREBP-1c=8.4，tFAS=9.18，tADFP=5.46，P＜0.05)，随着时间延长表达量逐渐增多，(FLO2,SREBP-1c=204.49，FLO2,FAS=38.2，FLO2,ADFP=154.31，P＜0.05;FHepG2,SREBP-1c=107.35, FHepG2,FAS=279.71, FHepG2,ADFP.=352.06, P＜0.05)，差异有统计学意义。
　　结论：
　　1、间歇性低氧可以诱导LO2和HepG2细胞发生脂质异常沉积
　　2、间歇性低氧诱导产生的ROS可能通过调节低氧诱导因子和脂肪分化相关蛋白的表达，影响HIF-1α-SREBP-1 c-FAS和ADFP途径导致肝细胞脂代谢异常，HIF-2α可能参与间歇性低氧诱导肝细胞脂变的早期事件。
　　3、活性氧和低氧诱导因子有可能成为研究非酒精性脂肪性肝病的新靶点。