Klotho基因G-395A与F352V多态性与子痫前期的相关性研究

背景与目的：
　　子痫前期属于妊娠期高血压(Hypertensive Disorders Complicating Pregnancy)疾病的范畴，是一种妊娠期特发性疾病，以孕期出现高血压和蛋白尿为主要临床表现的多器官损害疾病，该病对母胎影响极大，我国发病率9.4％，国外报道7％～12％，且近年发病率呈增高趋势。迄今为止，其病因和发病机制尚不明朗，类似盲人摸象，只是提出了很多假说，包括免疫假说、遗传假说、血管内皮损害和功能障碍、血管活性物质失衡、凝血和纤溶失调等，但多数学者倾向于遗传易感性。随分子生物学技术的日新月异发展，子痫前期的遗传学研究取得了较大进展，已证实多种基因的单核苷酸多态性(Single nucleotial polymorph-isms，SNPs)密切影响子痫前期的发病及遗传易感性，如血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)、肾素受体、VLeiden因子、凝血酶原(Prothrombin)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的基因及Survivin基因。
　　Klotho基因是日本学者Kuro等在1997年研究盐敏性高血压时发现的一种抗衰老基因，它编码的蛋白不仅具有抑制细胞衰老的作用，还具有增强细胞抗氧化应激的能力。近几年已发现，部分子痫前期患者的胎盘里Klotho蛋白及mRNA的表达明显低于同孕周、同时期产妇，而且重度子痫前期患者低于轻度子痫前期的患者。引起这种现象的原因可能是Klotho基因多态性影响Klotho蛋白表达水平，Klotho蛋白表达下降就会减弱其抗衰老及抗氧化应激的作用，从而胎盘滋养细胞过度衰老及血管内皮细胞重度损伤，引起其浸润能力不足，导致胎盘浅着床、胎盘的供血与供氧功能极度下降，进而引起子痫前期的一系列症状。本课题设计为子痫前期组与对照组、重度子痫前期组与轻度子痫前期组两组，采用等位基因特异性多聚酶链反应(Allele-specific polymerase chain reaction AS—PCR)技术分别检测此两组中klotho基因G395A和F352V基因型频率和等位基因频率的分布情况，分析klotho基因G395A和F352V多态性与子痫前期发病的相关性。
　　实验材料和方法：
　　1、研究对象
　　依据乐杰主编的第7版《妇产科学》教材的诊断标准，选取从2011年7月到2013年3月期间在郑州大学第二附属医院剖宫产分娩的子痫前期患者和正常妊娠妇女共382例，分组如下。
　　子痫前期组共182例包含轻度子痫前期98例和重度子痫前期84例，年龄范围为22岁～38岁，平均年龄（33.10±6.35）岁;孕周为24周～40周，平均孕周为（35.39±3.14）周。
　　对照组200例，为正常妊娠妇女，因产道或胎位异常、社会因素行剖宫产术者，年龄范围为18岁～38岁，平均年龄为（30.8±5.06）岁;孕周为33周～40周，平均孕周为（38.93±1.47）周。
　　研究对象的筛选条件为:
　　1、所有研究对象第一次单胎妊娠且没有使用辅助生殖技术，剖宫产前均未进入产程;
　　2、所有研究对象在近几代无任何血缘关系，夫妇双方均为汉族人群，长期在河南地区生活，无其他妊娠合并症及并发症;
　　3、无长期吸烟、饮酒及孕期大量服药史，无孕期外伤史与感染史，无输血及免疫治疗史。
　　2、研究方法
　　(1)首先，抽取研究对象的外周血并用盐析的方法提取其DNA，然后运用等位基因特异性多聚酶链反应(Allele-specific polymerase chain reaction AS—PCR)技术，检测klotho基因G-395A与F352V两个位点的基因型频率和等位基因频率在本课题设计的两组中的分布情况。
　　(2)其次，检验所得数据是否符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)遗传平衡定律。
　　(3)再次，试验数据通过软件SPSS17.0进行统计分析，采用RxC表卡方检验比较基因型和等位基因频率;同时运用非条件逻辑回归分析基因型与子痫前期的关联程度，并用比值比(odds ratio，OR)和95％置信区间(confi-dente interval,CI)表示。所得数据经分析后均以α=0.05、P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、临床资料的分析比较
　　经数据分析体重、孕周、产前体重指数(Body Mass Index，BMI)在对照组与子痫前期组，轻子痫前期组度与重度子痫前期组的差异均有统计学意义(P＜0.05);而年龄、身高在此两组研究对象的差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2、Klotho基因G-395A和F352V两个位点基因型分布频率进行拟合优度卡方检验
　　(1)在382例研究对象即子痫前期与正常对照组存在GG、GA、AA三种基因型，分别为GG型91例(23.8％)，GA型204例(53.4％)，AA型87例(22.8％)，A等位基因频率为49.5％，G等位基因为50.5％，符合Hardy-Wein berg平衡（x2=1.776，P=0.183）。
　　(2)在382例研究对象即子痫前期组与正常对照组存在FF、FV、VV三种基因型，分别为FF型273例(71.5％)，FV型99例(25.9％)，VV型10例(2.6％)，F等位基因频率为84.4％，V等位基因为15.6％，符合Hardy-Wein berg平衡（x2=0.081，P=0.776）。
　　3.1、Klotho基因G-395A位点多态性与子痫前期相关性分析
　　(1)子痫前期组等位基因A的基因频率高于对照组差异有统计学意义(x2=4.664，P＜0.05)。用SPSS17.0分析该基因G-395A位点与子痫前期的发病风险，结果表示A/G的相对危险度OR值为1.368，95％的置信区间CI为(1.029～1.819)。
　　(2)子痫前期组等位基因A的基因频率高于轻度子痫前期组差异有统计学意义（x2=11.378，P＜0.05）。用SPSS17.0分析该基因G-395A位点与子痫前期发病程度的风险，结果表示A/G的相对危险度OR值为2.055，95％的置信区间CI为(1.349～3.132)。
　　3.2、Klotho基因F352V位点多态性与子痫前期相关性分析
　　(1)子痫前期组与对照组的基因型FF的基因频率无明显差异(P＞0.05)，子痫前期组等位基因的F基因频率与对照组差异无统计学意义(x2=1.295，P=0.255)。
　　(2)重度子痫前期组与轻度子痫前期组的基因型FF的频率无明显差异(P＞0.05)，重度子痫前期组等位基因的F基因频率与轻度子痫前期组差异无统计学意义（x2=0.402，P=0.526）。
　　结论：
　　1.Klotho基因G-395A位点多态性可能与河南汉族妇女子痫前期的发病有关，AA基因型易发生子痫前期，A等位基因可能是河南汉族妇女发生子痫前期的危险因素，并与子痫前期的严重程度有关。
　　2.Klotho基因F352V位点的多态性可能与河南汉族妇女子痫前期的发病无相关性。