痛风方对高尿酸血症小鼠SLC2A9、SLC22A12的影响及疗效观察

目的:
　　痛风患者因社会经济发展而逐年增加，目前，我国经济发展飞速，人们的物质生活水平普遍较高，营养过剩、运动减少等因素导致高尿酸血症的发病率直线上升。而长期的高尿酸血症极易诱发痛风发作，还会累及肾脏、心血管系统和内分泌系统等疾病。目前，高尿酸血症所致的疾病已成为一大隐患，给病人带来了难以忍受的痛苦，严重影响着人们的生活质量，增加了国家和个人的医疗负担。高尿酸血症及其所致的相关疾病已成为医学生物学研究界的重要课题。
　　临床上认为高尿酸血症是指血液中的尿酸浓度持续超出正常范围的一种机体状态，一般认为正常男性血液中的尿酸浓度不大于400μmmol/L，正常女性血液中的尿酸浓度不大于360μmmol/L，否则应考虑为高尿酸血症。尿酸持续性升高或长期嘌呤代谢紊乱将导致一系列急、慢性疾病。多年来，高尿酸血症一直是医学领域的研究热点，作为一种代谢性疾病及临床上常见的一种体征和疾病的发病机制，在许多疾病过程中如:肾病、冠心病、高血压病、糖尿病、肥胖等都发挥重要作用。因此，降低血尿酸成为了治疗高尿酸血症造成的各种急慢性疾病的关键所在。
　　近代西方医学相关理论及证据证明高尿酸血症是与遗传基因的尿酸盐转运蛋白基因的SLC2A9基因和SLC22A12基因有很高的相关联性，认为SLC2A、SLC22A12蛋白基因的表达可以反映机体尿酸水平。因此本课题组认为治疗高尿酸血症可以通过改变或降低SLC2A、SLC22A12蛋白活性达到降低血尿酸的目的，以取得疗效。提出提高临床疗效及研究和探索临床药物的治疗机制和原理可以从SLC2A9、SLC22A12这两个基因的表达入手。
　　根据中医藏象功能与高尿酸血症的关系，认为脾肾两脏与高尿酸血症关系密切，本课题认为“高尿酸血症是‘脾肾亏虚’所致的湿热瘀阻证，并与五脏理论相关。脾主运化及肾主水功能失司可表现为尿酸升高;脾主运化及肾主水功能失司可表现为尿酸升高;甚则肌肉关节疼痛红肿，其中脾主运化功能失司主要表现为肌肉红肿疼痛，肾主水功能失司主要表现为骨骼关节疼痛;运用清利湿热‘痛风方’治疗高尿酸血症是通过改变与SLC2A9、SLC22A12的表达来降低OXD活性及血尿酸以取得疗效的”。认为血尿酸水平高即中医所言的痰浊、湿浊内蕴，瘀血阻络，侵袭人体皮肉筋脉所致。而这一系列变化的本质都是由于脾失健运，肾主水功能失调所致，其治疗方法采用清热祛湿，活血散结的方药进行治疗，研究SLC2A9、SLC22A12的表达变化，探讨痛风方的治病原理。因此，从脾肾两脏研究高尿酸血症的实质对于丰富中医藏象及病因理论，探索清热祛湿，活血散结的方药防治高尿酸血症相关疾病，找出痛风方的作用靶点具有重大意义。
　　方法:
　　1、实验研究
　　以SPF级成年KM小鼠作为研究对象。根据体重，采用随机数字表随机分为正常组（A组）、模型组（B组）、低剂量组（C组）、中剂量（D组）、高剂量组（E组）、阳性药物组（F组），共6组，每组12只，共72只。正常组不造模，每天给予生理盐水1ml/只灌胃进行对比;模型组给予升高血尿酸药物并连续1ml/只生理盐水灌胃5天进行造模;低剂量组给予升高血尿酸药物5天进行造模，期间并给予低剂量药物1ml/只进行治疗;中剂量组给予升高血尿酸药物5天进行造模，期间并给予中剂量药物1ml/只进行治疗;高剂量组给予升高血尿酸药物5天进行造模，期间并给予高剂量药物1ml/只进行治疗;阳性对照组给予升高血尿酸药物5天进行造模，期间并给予秋水仙碱药物1ml/只进行治疗。采用黄嘌呤加盐酸乙胺丁醇片建立高尿酸血症小鼠模型。观察高尿酸血症小鼠行为变化影响及中药痛风方的干预作用;中药痛风方对高尿酸血症小鼠黄嘌呤氧化酶(OXD)活性及血尿酸的影响;高尿酸血症小鼠SLC2A、SLC22A12抗体的阳性表达率及肾脏形态学改变的研究及中药痛风方的干预作用;观察高尿酸血症小鼠SLC2A、SLC22A12基因的改变及中药痛风方的干预作用;中药痛风方对高尿酸血症的临床疗效。
　　2、临床研究
　　收集2010年4月至2012年9月广州中医药大学第一附属医院就诊，以美国风湿病协会1977年制定的痛风诊断标准进行筛查，将临床上已确诊为高尿酸血症的患者病历64例，随机分为痛风方治疗组和安慰剂对照组，两组比例为1∶1，每组32例。予痛风方进行治疗（痛风方:苍术15g，牛膝10g，黄柏15g，苡仁30 g，川革薢30g，毛冬青30 g，黑老虎10 g，荆芥穗10 g（后下），猫须草30 g，徐长卿15 g，车前草30 g）。中药痛风方组予以上中药进行治疗，对照组采用安慰剂进行对照，疗程5天。观察患者治疗前后血尿酸的变化，在治疗前后检测患者基本生命体征、ALT、肌酐、尿素氮等的变化，以评价治疗的安全性。两组治疗结果进行比较，观察中药痛风方对血尿酸的影响和疗效。
　　上述数据均运用SPSS17.0统计软件中的单因素方差分析和卡方检验进行分析。
　　结果:
　　1、实验研究结果
　　1.1高尿酸血症小鼠行为学变化影响及中药痛风方的干预作用
　　1.1.1体重
　　各组小鼠体重实验前未见差异(P＞0.05)，在实验过程中体重变化不明显，造模7天当中，六组小鼠体重未见明显增减。造模后各组大鼠体重相似，经统计分析与空白组相比较未见差异(P＞0.05)。
　　1.1.2行为学
　　实验前，小鼠状态正常，活动活跃，没有明显病症。造模第2天上午给予致病药物的小鼠尿液颜色明显比正常组小鼠深（呈深黄色），造模第2天下午持续给予致病药物可见较空白组小鼠难以抓拿，反抗程度高。造模第3天上午给予治疗药物和阳性药物的组别小鼠比模型组小鼠相对安静，但可见活动略有异常，造模第3天下午致病药物小鼠活动活跃，狂躁，药物组与其他组有区别，相对安静但捉拿难。造模第4天上午致病药物小鼠表征并没有变化但小鼠相互攻击增多，有多处伤口。造模第4天下午持续造模和药物治疗，观察到模型组与其余组的尿液颜色有差异（呈深黄色）。造模第5天给药过程中，小鼠的反抗程度仍是比较大，需要大力抓拿，小鼠背部皮肤未见松弛，动作相对敏捷，小鼠表征正常，未见死亡现象。造模第6天小鼠表征正常，不同剂量组的小鼠表现并未明显差异但高剂量给药后明显有不适但持续时间并不长，而阳性药物组别因给药剂量的少并未见明显的不良反应，持续使用致病药物灌胃，模型组相对正常组食量减少但饮水量增多，小鼠表征并未出现明显病症，尿液颜色重。
　　1.2中药痛风方对高尿酸血症小鼠OXD活性及血尿酸的影响和作用机制各组小鼠与实验结束后取材进行OXD活性检测，发现与空白组相比较，模型组和低剂量组OXD活性明显增高，经统计学分析具有及显著差异(P＜0.01)，中剂量组小鼠OXD活性增强，经统计学分析具有显著性差异(P＜0.05)，而空白组与阳性药物组、高剂量组及中剂量组小鼠OXD活性升高不明显，统计学未见差异(P＞0.05)。与模型组相比较，高剂量组和阳性药物组OXD活性明显偏低，具有极显著差异(P＜0.01)。
　　实验结束后取血清进行尿酸检验，发现与空白组相比较，模型组、中剂量组和低剂量组血尿酸明显增高，统计学具有极显著差异(P＜0.01)，而空白组与高剂量组和阳性药物组则未见差异(P＞0.05)。与模型组相比较，高剂量组和阳性药物组尿酸明显偏低，统计具有极显著差异(P＜0.01)，中剂量组血尿酸相对偏低，具有差异(P＜0.01)。
　　1.3痛风方对高尿酸血症小鼠肾脏SLC2A9和SLC22A12蛋白表达的影响
　　1.3.1 HE染色结果
　　染色完成后在显微镜下观察各组小鼠肾脏形态变化，发现空白组及高剂量组小鼠肾小球和肾小管处细胞形态正常，核膜完整，染色质结构正常，基质密度均匀，肾间质未见明显炎症细胞及纤维增生;发现模型组、低剂量组和阳性对照组小鼠肾小球脏皮上层、近端及远端肾小管处细胞增生，甚出现管型细胞，间质可见单核细胞浸润:高剂量组小鼠肾小球脏皮上层、近端及远端肾小管处细胞小鼠细胞形态较正常，与空白组更接近。
　　1.3.2各组小鼠肾细胞SLC2A9和SLC22A12的蛋白表达
　　各组小鼠肾细胞中SLC2A9和SLC22A12的阳性表达均呈棕色，显微镜下可以很清晰的看到肾细胞，苏木素染核后，核呈现蓝色。SLC2A9的表达:空白组和药物组棕色较弱，SLC2A9的表达也较弱，模型组棕色光较强，SLC2A9的表达增多。SLC22A12的表达与SLC2A9的表达的结果相一致:空白组和药物组棕色较弱，SLC22A12的表达也较弱，模型组棕色光较强，SLC22A12的表达增多。
　　1.4痛风方对高尿酸血症小鼠肾脏SLC2A9和SLC22A12荧光定量PCR结果
　　各组小鼠肾组织中SLC2A9和SLC22A12基因的定量结果如下:空白组SLC2A9的定量结果较高，模型组的SLC2A9定量结果偏低，阳性对照组和高剂量组小鼠SLC2A9的定量结果接近空白组，低剂量组和中剂量组SLC2A9的定量处于模型组和空白组之间。SLC22A12的表达与SLC2A9的表达的结果相一致:空白组SLC22A12的定量结果为较高，模型组的SLC22A12定量结果较低，阳性对照组和高剂量组小鼠SLC22A12的定量结果接近空白组，低剂量组SLC22A12的定量和模型组接近，中剂量组SLC22A12的定量处于模型组和空白组之间。
　　2、临床研究结果
　　64例病例结果发现本研究实际入组病例为61例（脱失病例3例），其中对照组30例，治疗组31例，两组病例在年龄、身高、体重、吸烟、饮酒、遗传等方面无明显差异(P＞0.05)，具有可比性。统计结果显示治疗组血尿酸治疗前、后有明显差异(P＜0.01)，治疗组血尿酸均值低于治疗前;而对照组血尿酸在治疗前、后有差异(P＜0.05)，均值反而高于治疗前。综合疗效分析:治疗组治愈4例，好转24例，无效3例;治疗组治愈率6.6％，有效率80％;对照组治愈0例，好转6例，无效24例，有效率9.8％。总体疗效对比组间具有差异(P＜0.05)，具有统计学意义。
　　评价其安全性:治疗组和对照组对患者生命体征、ALT、BUN、CREA均无明显影响(P＞0.05);对照组治疗前后未见差异(P＞0.05)。研究中没有发现不良反应。
　　结论:
　　1、高尿酸血症对小鼠体重的改变不明显，高尿酸血症模型小鼠可正常生长发育。此外也说明了中药痛风方不会影响高尿酸血症小鼠的正常生长发育。
　　2、高尿酸血症可导致小鼠行为异常，主要表现为一般情况欠佳，并随之产生狂躁情绪及敌对反应，这种行为学的改变是部分可逆的，中药痛风方和秋水仙碱能适当改善小鼠异常行为，让高尿酸血症小鼠保持皮毛色泽光滑、皮肤弹性、减少敌对行为和平复狂躁情绪。
　　3、OXD活性结果和UA结果相一致。中药痛风方高、中剂量药物均能降低高尿酸血症模型小鼠血尿酸，而中药痛风方高剂量药物降低血尿酸作用更为明显，但中药痛风方低剂量药物则降低血尿酸作用不明显。
　　4、高尿酸血症会损害小鼠肾组织，使肾细胞受到损伤，而中药痛风方高剂量药物可以对抗高尿酸血症所致的这种肾损伤。中药痛风方高剂量药物通过升高肾组织SLC2A9和SLC22A12基因量，降低肾组织SLC2A9和SLC22A12的蛋白表达从而降低血尿酸以对抗高尿酸血症所致肾损伤。
　　5、中药痛风方可以明显降低高尿酸血症患者尿酸，具有安全性。