半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘气道炎症中作用的研究

研究背景：支气管哮喘（简称哮喘）是全球范围内常见的慢性呼吸道疾病，近年来在世界各国均有逐年上升的趋势，已成为严重威胁人类健康的一类疾病。据统计，全球约有3亿哮喘患者，全球患病率1％～18％，我国约有1000～3000万哮喘患者，并有不断增加的趋势。哮喘是一种由基因与环境因素共同导致的复杂疾病。尽管哮喘基础研究已取得较大的进步，但目前发病机制和发展环节尚未完全明确，临床上对于哮喘的急性加重以及重症哮喘的治疗亦不是很满意。因此，探讨哮喘气道炎症发病机制、寻找新的治疗或预防靶点是呼吸系统疾病研究重点和热点。
　　 支气管哮喘是一种以气道慢性炎症、粘液分泌增加、气道重塑及气道反应性增高为主要特征的免疫变态反应性疾病。其中，气道炎症为最主要的病理变化，并决定气道阻塞和气道高反应性的程度。随着研究的不断拓展和深入，关于哮喘发病机制的假说不断增多，得到最广泛关注的是哮喘发病的“卫生学假说”，其核心为Th1/Th2失衡。该学说认为哮喘的发生是由于体内Th1/Th2平衡失调所致，即正常人以Th1/Th2保持平衡，但哮喘患者体内则Th0向Th2分化过度，使Th2占优势。Th1/Th2失衡是哮喘发病的重要基础，Th2优势是过敏性哮喘形成及进展的关键性机制。除了炎症细胞和炎症介质，气道结构细胞特别是气道上皮细胞也参与气道炎症的发生与发展，气道上皮细胞(HBE)首先作为气道的第一道防线抵抗外来侵害，同时在气道固有免疫中也发挥着重要作用(一)研究证明HBE是哮喘联系固有免疫与获得性免疫的桥梁。随着对炎症性疾病的深入研究以及对炎症通路的逐步了解，炎症复合体(inflammasome)成为多种炎症性疾病的研究重点，其中研究最多的就是NLRP3炎症复合体。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrindomain3)炎症复合体是由NLRP3蛋白、凋亡相关点样蛋白(ASC)和Caspase-1组成的多蛋白复合体。NLRP3蛋白能通过ASC接合半胱氨酸天冬氨酸酶-1前体pro-Caspase-1(45KDa)组装成NLRP3炎症复合体，组装后的pro-Caspase-1能自动激活形成有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1(10KDa和20KDa)促进IL-1家族细胞因子（IL-1β，IL-18，IL-33等）成熟与分泌，从而参与炎症反应。
　　 为了揭示NLRP3炎症复合体组装后激活的Caspase-1在哮喘气道炎症的作用机制，本研究选择了C57BL/6小鼠和人气道上皮细胞(16HBE)作为研究对象，观察在哮喘小鼠模型以及人气道上皮细胞炎症微环境中Caspase-1的表达，以及下游细胞因子IL-1家族细胞因子的生成，并通过Ac-YVAD-cmk阻断Caspase-1活化观察其是否可以引起IL-1家族细胞因子表达的改变，从而为完善哮喘气道炎症机制研究及治疗方法上提供参考。
　　 第一部分小鼠哮喘模型建立
　　 目的：建立OVA致敏和激发雌性C57BL/6小鼠哮喘模型。
　　 方法：SPF级雌性C57BL/6小鼠（南方医科大学实验动物中心）18只，6-8周，体重18～20g，随机分为3组，对照组（A组）、哮喘组（B组）和Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk)组（C组），B、C组小鼠于实验流程第0天、7天、14天给予腹腔注射鸡卵蛋白(OVA)液200μl致敏，A组仅用生理盐水替代致敏。B、C组小鼠于第21-27天雾化激发，给予2％ OVA40ml，经超声雾化器雾化吸入30min，1次/天; C组每次激发前30min给予Ac-YVAD-cmk溶液5μg/g腹腔注射;对照组用生理盐水代替OVA雾化激发。术次激发24h后，各组小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱，用BUXCO无创肺功能检测仪记录气道反应性监测指标增强呼气间歇(Penh)值。第29天采用水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球放血处死，75％酒精消毒，行支气管肺泡灌沈术，回收BALF，离心取细胞沉渣，重悬充板行细胞计数;涂片，瑞氏染色，细胞分类计数;取右上肺组织4％多聚甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，常规HE染色，光学显微镜下观察组织形态，气管和血管周围炎症细胞浸润情况。
　　 结果：
　　 1.致敏、激发哮喘过程小鼠行为学观察:B组、C组诱发哮喘后后出现不同程度呼吸急促、立毛、前肢搔鼻和烦躁不安，然后出现口唇紫绀、呼吸急促、二便失禁、活动度减低等症状，而A组未见上述症状。
　　 2.无创肺功能检测气道反应性结果:当乙酰甲胆碱浓度为3.125g/L、12.5g/L、25g/L和50g/L时，各组Penh值比较，B组明显高于A组和C组，差异有统计学意义。
　　 3.BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分比:①BALF细胞计数:B组BALF细胞总数(28.43±3.45)×104/ml，高于A组（9.01±2.33）×104/ml和C组（22.89±4.61）×104/ml(F=46.682，P=0.000)。②BALF嗜酸性粒细胞百分数:B组嗜酸性粒细胞百分比为（22.35±4.91）％，明显高于A组（1.07±0.20）％和C组（13.58±2.13）％(F=71.916，P=0.000)。③BALF淋巴细胞百分数:B组淋巴细胞百分比为（32.32±6.12）％，明显高于A组(10.76±2.02)％和C组（18.50±3.18)％(F=34.688,P=0.000)。
　　 4.肺组织病理学观察:A组小鼠肺组织细支气管和肺泡结构清晰，未见明显炎症浸润;B组小鼠细支气管壁和周围有大量炎症细胞浸润，主要为淋巴细胞，支气管腔内可见粘液分泌，C组小鼠细支气管壁和周围可见炎症细胞浸润，杯状细胞增生，但与哮喘组相比，支气管和血管周围炎症明显减轻。
　　 结论：雌性C57BL/6小鼠OVA联合铝剂腹腔注射致敏后，再用OVA雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型，出现哮喘症状和气道反应性增加，符合哮喘气道炎症的病理生理改变。
　　 第二部分哮喘小鼠肺部Caspase-1表达和IL-1β、IL-33生成
　　 目的：观察哮喘小鼠肺部Caspase-1表达和下游细胞因子IL-1β、IL-33的成熟与分泌，探讨可能的机制。
　　 方法：取3组动物肺组织标本各3份，1份采用Trizol试剂提取总RNA，逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)，以此为模板行PCR扩增。采用实时荧光定量PCR(real time quantitative-PCR)检测Caspase-1 mRNA表达水平;1份加预冷的含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液，冰磨3～5min，离心取上清，BCA法测定蛋白含量，绘制标准曲线，计算蛋白浓度，SDS-PAGE电泳和免疫印记反应，半干法转膜，显色，曝光，1mage J软件分析;1份用预冷的PBS冲洗后滤纸吸干，称重，剪刀剪碎后，加入PBS液，冰磨2min，离心取上清，BCA法测定蛋白含量，参照试剂盒说明书进行IL-1β、IL-33的检测。
　　 结果：
　　 1.小鼠肺组织中Caspase-1 mRNA的表达:每个样本的Caspase-1的相对mRNA表达水平直接用样品各自管家基因GAPDH的表达来标准化初始mRNA量。以2-ΔΔCt值比较，A组（2.12±1.33）和C组（5.99±4.20）均低于B组（15.97±8.67），差异有统计学意义。(F=10.653，P=0.004)。
　　 2.小鼠肺组织Caspase-1蛋白的表达:通过Image J软件分析B组Caspase-1/β-actin（0.56±0.03）较A组(0.47±0.03)和C组（0.28±0.03）明显升高，差异有统计学意义(F=73.916，P=0.000)3.IL-1β和IL-33的分泌: B组肺组织匀浆上清IL-1β（76.49±9.43）pg/mg及IL-33（73.08±6.67）pg/mg含量均高于A组[(37.51±9.13)pg/mg，P＜0.05;(32.79±5.92)pg/mg, P＜0.05）和C组[(64.74±8.65)pg/mg, P＜0.05;(46.94±2.38)pg/mg, P＜0.05)。
　　 结论：Caspase-1活化及其下游IL-1家族细胞因子（IL-1β，IL-33）增加并参与哮喘气道炎症。
　　 第三部分脂多糖诱导人气道上皮细胞Caspase-1表达
　　 研究目的：观察LPS诱导人气道上皮细胞过程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表达情况。
　　 方法：16HBE细胞复苏后以RPMI-1640（含10％胎牛血清）为基本培养液，0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化传代，每周传代2-3次。2×105/ml接种于6孔细胞培养板培养24h后贴壁，用PBS液和无血清RPMI-1640培养基清洗，37℃，5％CO2培养箱中无血清RPMI-1640培养基培养，用LPS(10μg/ml)预先将16HBE细胞致敏，制备气道上皮细胞哮喘模型，37℃、5％CO2培养箱内培养24h，PBS液为空白对照，LPS组加LPS（10μg/ml）培养24 h;LPS+组Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk)（以下简称LPS+cmk组）先用Ac-YVAD-cmk（10μmol/L）预处理，1h后再加入LPS(10μg/ml)培养至24h。四氮唑盐(MTT)法测定各组细胞增殖能力，RT-PCR检查各组细胞Caspase-1 mRNA的表达，western blot检测各组细胞Caspase-1蛋白表达，ELISA检测各组细胞上清液中IL-1β的生成。
　　 结果：
　　 1.MTT检测及OD值测定:三组人气道上皮细胞MTT检测及OD值测定。阴性对照组OD值为0.57±0.10，LPS组OD值为0.54±0.06，LPS+cmk组OD值为0.51±0.08，各组OD值比较P＞0.05(P=0.611，F=0.520)，各组细胞增殖无显著差异。
　　 2.各组细胞Caspase-1 mRNA的表达:以2的-ΔΔCt次方比较，对照组（1.33±0.33）和LPS+cmk组（1.50±0.24）均低于LPS组（3.11±0.57），各组间差异有统计学意义(F=17.564，P=0.003)。
　　 3.各组细胞Caspase-1蛋白的表达:以灰度扫描结果（Z值）比较，LPS组为0.85±0.11，LPS+cmk组为0.48±0.06，对照组为0.24±0.03。LPS+cmk组与对照组Z值均小于LPS组，差异有统计学意义(F=55.158，P=0.000)。
　　 4.各组细胞上清液IL-1β含量变化:与LPS组[(52.34±2.47)pg/ml]相比，阴性对照组[(15.73±6.83)pg/ml]和LPS+cmk组[(38.15±5.97)pg/ml]均降低，三组间差异有统计学意义(F=46.208 P=0.000)。
　　 结论：Caspase-1活化参与LPS致人气道上皮细胞炎症过程，并促进下游IL-1β的生成。