PPARγ激动剂罗格列酮对体外脂多糖刺激的枯否细胞中ⅠκB激酶β表达影响的研究

目的：非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是以肝细胞脂肪变性、小叶内炎症伴灶性坏死为特征的一类遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征，常合并肥胖、糖尿病和高脂血症，约30％NASH患者可进展为肝纤维化，甚至肝硬化，而成为隐源性肝硬化的重要原因之一。目前，NASH确切发病机制尚未完全阐明，最为成熟的“二次打击”学说认为，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、内毒素血症、氧化应激、脂质过氧化及炎症细胞因子活化等多种因素互相关联，共同参与NASH的病理生理环节。 枯否细胞(kupffer cells，KCs)虽为肝内固定的巨噬细胞，但承担着全身单核巨噬细胞系统80％-90％的功能，其活化在内毒素(endotoxin，ET)介导的肝脏炎症及免疫损伤中发挥至关重要的作用。众所周知，核因子-кB(nuclearfactor-кB，NF-кB)是体内广泛存在的对氧化应激敏感的一种前炎症介质基因核转录调控因子，通常情况下，大多数NF-кB与其抑制蛋白(NF-кB inhibitor，IкB)结合成无活性的二聚体，存在于胞浆中，仅少数处于活化状态，参与维持细胞生长、抗凋亡等生理功能。在病理状态下，内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通过活化IкB激酶β(inhibit kappa B kinase β，IKKβ)，磷酸化降解IкB，引起IкB/NF-кB二聚体解离，导致NF-кB大量活化并迅速移位核内，与DNA上特异性靶基因序列结合，启动、调控众多细胞因子、粘附分子和炎症相关的酶及蛋白质的表达，诱导NASH的发生发展。罗格列酮(rosiglitazone，Ros．)为噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，其通过激活靶组织中特异性受体，即过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)调节糖、脂代谢，改善胰岛素抵抗；此外亦有研究表明，PPARγ在KC中也广泛表达，罗格列酮通过抑制NF-кB的活性，参与调控肝组织炎症反应，但其是否通过IKKβ信号通路发挥作用目前尚未明确，对于肝脏PPARγ与IKKβ之间相互关系的研究亦罕见报道。本研究旨在通过肝脏炎症调控细胞-枯否细胞的体外分离培养，LPS刺激模拟肝脏炎症反应，并应用PPARγ特异性激动剂罗格列酮干预，观察细胞中IKKβ mRNA表达变化，以探讨NASH损伤的分子机制，明确PPARγ激动剂罗格列酮抑制NF-кB活化的信号通路，为今后NASH的有效防治提供新的思路。 方法：健康雄性Wistar大鼠12只，体重140±10g，标准饲料喂养一周后，采用原位肝门静脉插管，Ⅳ型胶原酶消化、密度梯度离心以及差速贴壁分离等方法分离、纯化大鼠肝脏正常KC，细胞得率约为(0.5-1.0)×10<'7>/鼠肝，0.4％台盼兰染色鉴定细胞存活率>95％，以2×10<'6>浓度接种于6孔板，并以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5％CO<,2>培养箱培养。其中一孔置于荧光显微镜下观察，328nm处无自发荧光，然后向该孔加入20μl India ink(以1％明胶稀释20倍)，培养4h后以含10％胎牛血清RPMI 1640冲洗，倒置相差显微镜下观察细胞浆内吞噬颗粒，鉴定KC纯度及其吞噬活性>90％。余培养孔细胞继续标准培养24h后随机分为四组(每组12复孔)： a组：正常对照组b组：LPS 1μg/ml组c组：LPS 1μg/ml+Ros．10μmol/L组d组：LPS 1μg/ml+Ros．50μmol/L组标准培养24h后换液，分别加入含相应浓度LPS及罗格列酮的10％胎牛血清RPMI-1640培养基继续干预培养48h，倒置相差显微镜下观察细胞形态及吞噬活性变化，收集培养细胞上清液(kupffer cell-conditioned mediumKCCM)，-80℃冰箱保存，酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)法检测TNFα水平；Trizol试剂盒一步法提取KC中总RNA，逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测KC中IKKβ mRNA表达。 结果： 1．置相差显微镜下KC形态变化：正常KC培养30min后即开始贴壁，12h伸出伪足，24h后形态舒展完全，呈星形或多角形。与正常KC相比，LPS刺激可促进细胞体积增大，早期出现形态改变且细胞形态舒展明显，细胞核增大、胞浆疏松；功能测定发现，KC吞噬墨汁及分泌TNFα能力均增强。应用罗格列酮可显著抑制LPS的诱导作用，延缓细胞形态改变，延长细胞生存期，且作用强度与罗格列酮浓度呈正相关。 2．KC培养上清液中TNFα含量改变：与正常对照组(1.310±0.038)比较，LPS 1μg/ml组中TNFα含量显著增高(1.856±0.049 P<0.01)；应用罗格列酮干预后TNFα水平升高幅度明显降低，与LPS 1μg/ml组比较差异有显著统计学意义(1.791±0.046，1.754±0.056 P<0.01)，且两实验组间比较亦存在统计学差异(P<0.05)。 3.IKKβ mRNA在KC中的表达：正常对照组KC中IKKβ mRNA表达量很低(0.224±0.014)，LPS刺激后表达量明显增强(0.753±0.019 P<0.01)，应用罗格列酮干预培养可明显抑制IKKβ mRNA表达升高(0.515±0.023，0.410±0.021 P<0.01)，且两实验组间统计学差异显著(P<0.01)。相关分析表明，各组KC中IKKβ mRNA表达与细胞培养上清液中TNF α含量均呈正相关(r值分别=0.676，0.809，0.753，0.626 P<0.05或<0.01)。 结论： 1.应用Ⅳ型胶原酶消化、密度梯度离心和差速贴壁分离的方法可以成功分离纯化大鼠肝脏枯否细胞，为体外模拟肝脏炎症反应提供基础。 2.LPS刺激活化的KC中IKKβ mRNA表达增加，进而通过IKB/NF-кB/TNFα信号通路诱导组织炎症介质合成释放，在NASH大鼠肝脏炎症病变形成过程中发挥重要作用。 3.IKKβ处于多种信号转导途径的交叉点，通过诱导胰岛素抵抗、激活炎症信号通路等途径参与脂肪性肝炎的病理过程。 4.PPARγ特异性激动剂罗格列酮可通过改善胰岛素抵抗及阻断IKKβ信号通路，拮抗炎症介质合成释放，抑制组织细胞炎症反应，为NASH的有效防治提供了新的思路。