SATB2表达与非小细胞肺癌增殖和转移相关

前言
　　肺癌是我国发生率最高的恶性肿瘤，严重威胁着人民群众的健康。探索肺癌的发生发展机制，一直是医学研究者们不懈的追求。而肺癌的增殖及转移是造成患者死亡的最重要原因。SATB(SpecialAT-richsequence-bindingprotein，特异AT序列结合蛋白)是与MARs（核基质附着区）结合的转录因子，在转录调控和染色质重组等过程中发挥重要作用。最近关于乳腺癌的研究中，提出SATB1为关键点的新的基因调节模式，在该模式中SATB1作为“基因组组织者”，全面地重塑染色质结构和大量的基因转录群，促进肿瘤进展和转移，显著地改变了乳腺癌细胞的基因表达谱，诱导其出现侵袭表型，从而促进肿瘤的生长和转移。SATB2是成骨细胞分化和骨基质形成过程，及中枢神经系统发育中的关键调控因子。SATB2基因缺失引起2q33.1微缺失综合征等，对唇腭裂和神经发育迟滞有影响。SATB2作为SATB1的同源基因在许多肿瘤中亦发挥重要作用。在喉癌、结直肠癌中SATB2表达减少，并提示预后不良。SATB2在非小细胞肺癌中的表达及在肿瘤细胞生物学行为中的作用尚不清楚。
　　材料与方法
　　一、材料
　　（一）临床资料
　　购买上海芯超生物科技有限公司病理组织芯片三张（OD-CT-DgLug01-007、OD-CT-RgLug01-008、OD-CT-RgLug01-009），共病理标本128例，其中肺腺癌60例，肺鳞癌68例。
　　（二）细胞系
　　肺癌细胞系A549（人肺腺癌系）、H1299（人肺腺癌系）、NCI-H460（人大细胞肺癌系）、LTE（人肺腺癌系）均购自上海中科院细胞生物所，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液进行传代。血清购自BI公司，RPMI-1640培养液及DMEM培养液购自Hyclone公司。
　　（三）实验用品
　　1、主要试剂
　　SATB2兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司，DAB酶底物显色试剂盒和S-P超敏试剂盒均购自广州中衫金桥生物科技有限公司，Lipo2000购自上海英潍捷基，siCONTROL及siSATB2购自广州锐博生物科技有限公司。plncx2及plncx2-SATB2质粒均由中山大学肿瘤研究中心曾木圣教授惠赠。
　　2、试验仪器
　　摊片机(LS-90)沈阳龙首电子仪器公司
　　烤片机沈阳龙首电子仪器公司
　　冰箱青岛海尔股份有限公司
　　恒温箱沈阳医疗器械厂
　　电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司
　　压力锅苏泊尔炊具股份有限公司
　　免疫组化保湿盒福州迈新生物技术有限公司
　　医学图像采集分析系统日本Olympus公司
　　低温超速离心机和低速离心机Hitachi，日本
　　紫外分光光度计和凝胶成像系统UVP，英国
　　CO2培养箱Heraeus，德国
　　超净台苏州净化设备
　　ABI7900HT仪器AppliedBiosystems,USA
　　NanoDropND-1000spectrophotometer(Wilmington,USA)
　　基因扩增仪G-Storm，英国
　　电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗
　　超声细胞粉碎机宁波新芝
　　电泳及转印仪Bio-Rad，美国
　　二、方法
　　1、免疫组织化学技术
　　采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法DAB试剂盒（中山金桥，北京）行抗SATB2(1∶500)免疫组织化学染色。切片常规脱蜡、水化，3％过氧化氢去除内源性过氧化物酶，高温高压热修复，柠柠檬酸盐抗原修复液2分钟，蒸馏水冲洗5'×3遍、PBS5'×3遍，非免疫动物血清室温孵育10分钟，以封闭特异性位点，去血清加一抗SATB2(1∶200)，4℃于冰箱孵育过夜，蒸馏水冲洗、PBS冲洗5'×3遍。加即用型广谱试剂盒C液室温呼育20分钟。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5'×3遍，加即用型广谱试剂盒D液，室温20分钟。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5'×3遍，DAB显色。苏木素复染，酒精梯度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。
　　2、细胞培养
　　细胞使用RPMI1640培养基含10％的胎牛血清。37℃、5％CO2的条件下培养，每两天换一次液，并用0.25％的胰酶进行传代。
　　2、细胞瞬时转染和转染效率测定
　　转染前一天将细胞按60％-70％密度接种于6孔板，采用LipofectamineTM2000(英潍捷基，上海)转染试剂按照说明书进行转染，24h测转染效率，并终止细胞培养，用于后续试验。Westernblot检测转染效率。
　　4、Westernblot
　　收集培养的细胞，加入蛋白裂解液充分裂解，4℃静置，孵育40min，4℃离心20min（12000g/min），取上清，放入-70℃冰箱保存。用Brodford法测蛋白浓度，每孔50ug蛋白上样量，12％SDS-PAGE凝胶电泳，4℃，40V条件下湿电转移仪将蛋白转入0.22umPVDF膜，50％脱脂奶粉封闭2h，一抗(SATB21∶500，β-action1∶1000)4℃过夜，37℃二抗孵育2h，化学发光，显影，以β-actin为内参，用凝胶成像分析系统（BioImagingSystems，美国）分析蛋白条带灰度值，每组结果均为相同条件重复3次。
　　5、细胞增殖实验
　　使用MTT法检测细胞的增值能力。
　　6、Transwell肿瘤侵袭实验
　　使用24孔板Transwe11小室，孔径8um进行细胞侵袭能力检测，随机选取10个高倍镜视野取平均值。每个实验组重复三次实验。
　　7.统计学分析
　　应用SPSS19.0统计软件进行数据处理:采用mean±SD分析各组数据的平均值和标准差。采用OnewayANOVA，DunnettT3进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.SATB2低表达与NSCLC临床病理因素相关
　　2.SATB2低表达与预后负相关，提示病人预后不良
　　3.SATB2表达水平与NSCLC侵袭能力相关
　　4.SATB2表达水平与NSCLC增殖相关
　　结论
　　SATB2表达与NSCLC分化、淋巴结转移、TNM分期负相关，与预后正相关，提示SATB2可作为NSCLC预后不良因子。SATB2表达抑制肺癌细胞的增殖和侵袭。