PPARα及HNF4α与2型糖尿病及脂肪肝的关系及罗格列酮的保护作用

目的：非酒精性脂肪肝fNonalcoholic fattv liver disea-se，NAFLD)发病率逐年升高，该病常与腹型肥胖、2型糖尿病、高脂血症同时存在。近年来研究发现NAFLD与2型糖尿病、胰岛素抵抗密切相关，胰岛素抵抗及2型糖尿病可能是NAFLD形成的启动因素，并且在其形成过程中可能起中心作用。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome pr01iferator activated receptor α)PPAR α是一种由配体激活的转录因子，属于核受体超家族成员。具有调节脂肪代谢和调节炎症、免疫以及细胞分化等作用，在NAFLD发病起着很重要的作用。肝细胞核因子(hepatocyte nuclear facto-4 α，HNF4 α)是高度保守的胆固醇/甲状腺激素受体超家族成员，在肝脏、肾脏和肠及胰岛细胞中表达的，其对NAFLD发病起着重要的作用，已有的研究表明，高脂饮食诱导的大鼠胰岛素模型肝脏发生NAFLD变化，肝脏HNF一4 α mRNA降低，本研究进一步探明高脂饮食+小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病大鼠肝脏的变化及肝脏HNF-4 α mRNA及PPAR α mRNA表达的变化。噻唑烷二酮类化合物(thiaz01idineline，TzD)是一类作用于PPAR γ受体，治疗2型糖尿病的新药，为进一步阐明NAFLD的发病机制，并寻找和发现有效防止NAFLD新方法也已经成为医学界研究的重要课题。 本研究旨在： 1 通过高脂饮食喂养+小剂量STZ建立wistar大鼠2型糖尿病动物模型，该模型具有腹型肥胖、高血糖、高胰岛素血症、高血脂、胰岛素敏感性降低、脂肪肝的特点。 2 探讨PPAR α mRNA及HNF4 α mRNA在NAFLD发生时在肝脏表达的变化。 3 噻唑烷二酮类(thiazolidinedine，TZD)对2型糖尿病及NAFLD的干预作用。 方法：健康Wistar雄性大鼠45只，适应性喂养2周后，随机分为普通饮食组(正常对照组A组)15只，和高脂饮食组(实验组)30只，给予高脂饮食喂养8周，按李光伟HOMA指数判断出现胰岛素抵抗后，腹腔注射STZ造模。除意外死亡和未成模者外，将剩余成模大鼠随机分为2组(每组12只)：2型糖尿病组(B组)，继续高脂饲料喂养；罗格列酮治疗组(C组)，高脂饲料喂养同时罗格列酮3mg/kg/d灌胃给药。所有大鼠试验期间自由饮水，进食。分笼饲养，每笼5只。每组大鼠均于实验开始、实验结束时称量体重、取血。大鼠自试验前一日20：00起禁食，实验日8：00分别自内眦静脉采血3毫升，分离血清，保存于．20℃用于各项指标的检测。实验结束时，留取部分肝脏于液氮保存，用于测PPAR α mRNA及HNF4 α InRNA的表达，其余用多聚甲醛固定，待光镜下组织学检测。 1 血糖、胰岛素的测定胰岛素用放射免疫法测定。采用稳态模型fHomeoestasisModel AssementHOMA)及胰岛素敏感指数(InsulinSensicivitv Index，ISI)评价胰岛素抵抗的程度。 2 血脂的测定甘油三脂(triglyceride TG)总胆固醇(total ch01ester01e，TC)高密度脂蛋白highdensity lipoprotein-ch01esterole HDL-C)比色法测定，低密度脂蛋白胆固醇(10werdensitylipoprotein．cholesterole，LDL-C)由Friedewald公式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出以(mmol/l计)。Cu<'+>比色法测定游离脂肪酸(FFAs)含量。 3 肝脏PPAR α mRNA及HNG4 αmRNA表达的测定用Trizol Kit提取肝脏组织RNA，反转录-聚合酶链反应fRT-PCR)分别扩增PPlAR α、HNF4 α和β-actin mRNA，扩增产物经琼脂糖电泳、摄片和计算机图像扫描。RT-PCR产物半定量：因β-actin在组织中均匀表达，PPAR α、HNF4 α基因的表达水平用靶基因与β-actin的比值表示。 4 肝脏形态学检查常规方法制备大鼠肝脏光镜组织切片，进行病理学观察。 5 统计学处理所有数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组问差异用两样本均数的t检验进行比较，两组以上比较采用单因素方差分析和直线相关分析作统计学处理。检验的显著性用P值表示。P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。 结果 1 对体重的影响实验初期，大鼠随机分组，各组体重无统计学差别。实验末期，正常对照组体重明显低于模型组及罗格列酮干预组，有显著性差异(P<0.05)。罗格列酮干预组体重与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。 2 对血糖和胰岛素的影响STZ造模前各组大鼠空腹血糖无差别。腹腔注射STZ后，模型组与罗格列酮干预组血糖明显高于正常组，有极显著性差异(P<0.01)。罗格列酮干预组血糖低于模型组(P<0.01)。模型组胰岛素水平明显高于正常组与罗格列酮干预组胰岛素水平，有极显著性差异(P<0.01)，正常组胰岛素水平较罗格列酮干预组减低(P<0.05)。 3 对血脂的影响STZ造模后模型组大鼠的TC、TG及FFA均明显升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。罗格列酮干预组的TC、TG及FFA比模型组明显降低，但仍高于正常组。 4 肝脏病理变化：肉眼观正常对照组肝脏呈红褐色，质软，模型组及罗格列酮干预组均呈浅黄色或土黄色，触之油腻，切开时有油滴，较粗糙，易碎。HE染色观察肝细胞发生气球样变、点状坏死、脂肪变性。 5 肝脏PPAR α mRNA及HNF4 α mRNA表达水平的变化PPAR α mRNA的表达在模型组表达减弱，低于对照组，有显著差异(P<0.01)，罗格列酮组干预组高于模型组，差别有显著性(P<0.01)。模型组肝脏HNF4 α mRNA表达水平较对照组降低，差别有显著性(P<0.01)，罗格列酮干预组表达水平高于模型组，差别有显著性(P<0.05)。 结论 1 高脂喂养8周可诱发大鼠胰岛素抵抗，该模型具有空腹血糖不高，高胰岛素血症、高血脂、胰岛素敏感性降低、肥胖的特点。 2 型糖尿病可并行脂肪性肝病，肝脏PPAR αmRNA及HNF4α mRNA表达水平减弱，罗格列酮干预组表达有所恢复，说明二者可能参与2型糖尿病脂肪性肝病的发病过程，罗格列酮对2型糖尿病性脂肪性肝病有保护作用。