亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型建立及其相关机制的研究

前言
　　二氯乙烷(Dichloroethane，DCE)系卤代烃类化合物，为工业上常用的有机溶剂之一，主要用于粘合剂、溶剂和氯代烃的生产。DCE有二种异构体，其中1，2-DCE属高毒类，职业中毒均为1，2-DCE引起。1990年以前，国内外有关1，2-DCE职业中毒的报道很少。但1990年以后，国内的多个省份陆续发生了多起严重的亚急性1,2-DCE职业中毒事故，其临床表现以中毒性脑病为主，脑水肿为其主要的病理过程。目前，亚急性1，2-DCE职业中毒已成为严重危害我国劳动者健康与生命的职业病之一。但有关1，2-DCE中毒性脑水肿机制的研究资料很少，亟待进行深入研究。
　　关于脑水肿的形成机制有众多学说，传统的脑水肿发生机制学说包括“血脑屏障损伤”、“能量代谢障碍”、“氧自由基损伤”、“钙离子超载”及“神经递质兴奋性毒性损伤”等。其中，血脑屏障损伤和能量代谢障碍学说被认为是血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿发生的基础。近年来，随着人们对脑水肿机制研究的不断深入，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)和水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)表达异常在血管源性和细胞毒性脑水肿形成和发展过程中的作用受到了广泛的关注。
　　本研究以昆明种小鼠为研究对象，通过建立亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型，深入探讨AQPs和MMPs表达、脑组织能量代谢及血脑屏障功能等在亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿发生与发展过程中的改变，为揭示亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿的可能发生机制提供实验参考数据。
　　方法
　　1、实验动物分组与染毒
　　实验一，脑水肿实验动物模型的建立:选用雌性健康昆明种小鼠40只，随机分为对照组及1.1、1.2和1.3mg/L1，2-DCE染毒组，每组10只小鼠。将实验动物置于100L静式染毒柜中，每天染毒3.5h。染毒结束后的次日观察小鼠中毒症状和死亡情况，若某组小鼠的死亡达半数以上，则终止整个实验，并处死各组剩余的存活小鼠。对照组小鼠除不暴露1，2-DCE外，其余处理过程同染毒组小鼠。
　　实验二，脑水肿发生机制的研究:选用雌性健康昆明种小鼠200只，随机分为对照组及1.2mg/L1，2-DCE染毒1d、2d和3d组，每组50只小鼠。将小鼠置于100L静式染毒柜中，染毒组小鼠以1.2mg/L1，2-DCE每天染毒3.5h。对照组小鼠除不暴露1，2-DCE外，其余处理过程同染毒组小鼠。
　　2、指标测定
　　染毒结束后，乙醚麻醉，断头处死小鼠，快速取脑组织进行如下检测。
　　2.1脑含水量测定
　　脑含水量(％)=（湿重-干重）/湿重×100％。
　　2.2脑组织病理学观察
　　取一侧脑组织，甲醛固定72h后，普通石蜡包埋，连续冠状切片，片厚5μm，常规HE染色，普通光镜下观察。
　　2.3脑组织中AQP4、MMP2和MMP9表达的测定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫荧光组织化学法分别检测小鼠脑组织中AQP4、MMP2和MMP9蛋白和mRNA的表达。
　　2.4脑组织能量代谢相关指标的测定
　　采用生化试剂盒法分别检测小鼠脑组织中ATP和乳酸含量及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。
　　2.5血脑屏障超微结构观察
　　取另一侧脑组织，低温快速切取约1mm3脑皮质，用2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液4℃下固定24h，1％锇酸固定2h，梯度酒精脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，采用透射电子显微镜进行脑皮质中血脑屏障超微结构的观察。
　　2.6脑组织中ZO-1和Occludin表达的测定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫荧光组织化学法检测小鼠脑组织中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA的表达。
　　3、统计分析
　　实验数据采用SPSS16.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用q检验(SNK)。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。
　　结果
　　一、亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型的建立
　　1、各组小鼠1，2-DCE中毒的表现
　　染毒3天后，1.2和1.3mg/L染毒组的存活小鼠除出现程度不同的行动迟缓和躯体震颤外，在被抓尾提起时，小鼠表现有明显的双前肢交叉及双后肢紧抱现象。除外，1.3mg/L染毒组共有6只小鼠死亡，1.2mg/L染毒组共有3只小鼠死亡。1.1mg/L染毒组无小鼠死亡，但1只小鼠有轻微中毒表现。
　　2、1,2-DCE染毒对各组小鼠体重增长的影响
　　1.3mg/L染毒组小鼠的体重随着实验天数的增加呈下降趋势。1.2mg/L染毒组小鼠的体重在染毒1d时上升，随后也呈下降趋势，对照组和1.1mg/L染毒组小鼠的体重均呈缓慢上升趋势。
　　3、1，2-DCE染毒对各组小鼠脑含水量和脑脏器系数的影响
　　1.2和1.3mg/L染毒组小鼠的脑含水量和脑脏器系数均显著高于对照组。但1.1mg/L染毒组小鼠的脑含水量和脑脏器系数与对照组比较均未见显著差异。
　　4、1，2-DCE染毒对小鼠脑组织结构影响的病理学观察
　　对照组小鼠的脑组织结构清晰，未见异常改变。而1.2和1.3mg/L染毒组小鼠的脑组织中，细胞核周围腔隙增宽，胞浆淡染，胞体肿胀变性，边缘模糊;部分细胞及毛细血管周围腔隙扩张等，呈现典型的脑水肿病理改变。1.1mg/L染毒组小鼠的脑组织结构中未见明显脑水肿病理改变。
　　二、亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿发生机制的研究
　　1、1，2-DCE染毒对各组小鼠脑组织中AQP4、MMP2和MMP9表达的影响
　　染毒2d和3d组的小鼠脑组织中AQP4蛋白含量及MMP9mRNA含量显著高于对照组，而染毒3d组的小鼠脑组织中MMP2和MMP9蛋白含量及AQP4mRNA含量也显著高于对照组;但各染毒组小鼠的脑组织中MMP2mRNA含量与对照组小鼠比较未见明显改变。染毒1d组的小鼠脑组织中AQP4、MMP2和MMP9表达与对照组比较均未见显著差异。
　　2、1,2-DCE染毒对小鼠脑组织中能量代谢的影响
　　染毒3d组的小鼠脑组织中ATP含量显著低于对照组，而染毒3d组的小鼠脑组织中乳酸含量显著高于对照组。
　　各染毒组小鼠的脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性与对照组相比均呈下降趋势，其中染毒2d和3d组的小鼠脑组织中Ca2+-ATPase活性均显著低于对照组。染毒3d组的小鼠脑组织中Na+-K+-ATPase活性也显著低于对照组。
　　3、1,2-DCE染毒对小鼠的血脑屏障超微结构的影响
　　对照组小鼠的脑组织毛细血管管腔形态规则、内皮细胞厚度适中，内皮细胞间的紧密连接结构清晰，基底膜厚薄均一，基底膜外有星形胶质细胞终足围绕;染毒1d组的小鼠脑组织毛细血管内皮细胞厚薄不等，但紧密连接结构尚完整;染毒2d组的小鼠脑组织毛细血管管腔狭窄、闭塞，内皮细胞间紧密连接松散。染毒3d组的小鼠脑毛细血管内皮细胞间紧密连接出现大量溶解、脱落，基底膜片状溶解、缺失，星形胶质细胞终足极度水肿，呈现为大片电子空白区。
　　4、1，2-DCE染毒对小鼠脑组织中毛细血管内皮细胞间紧密连接蛋白的影响
　　各染毒组小鼠的脑组织中ZO-1和Occludin蛋白含量与对照组相比均呈下降趋势，其中染毒2d和3d组的小鼠脑组织中ZO-1和Occludin蛋白含量显著低于对照组小鼠。
　　各染毒组小鼠的脑组织中ZO-1和OccludinmRNA水平与对照组相比也呈下降趋势，其中染毒2d和3d组的小鼠脑组织中ZO-1和OccludinmRNA水平也显著低于对照组小鼠。
　　结论
　　1、1.2mg/L1，2-DCE每天染毒3.5h、连续染毒3d可建立亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型。
　　2、AQP4介导的细胞内水潴留、细胞内钙超载及血脑屏障破坏可能在1，2-DCE所致的脑水肿发生机制中发挥重要作用。