黑曲霉脂肪酶A在毕赤酵母细胞表面的展示研究

黑曲霉被美国食品和药品管理局(FDA)认定为GRAS生物,其产生的脂肪酶催化水解或合成甘油三酯具有高度的1,3-位置特异性,广泛应用于食品添加剂、油脂改性、手性化合物拆分及清洁添加剂等领域。然而,目前其主要以游离态形式予以应用,在有机溶剂中易失活,并难以回收重复利用,生产成本高。针对游离态酶在应用中的上述缺陷,拟利用微生物表面展示技术将黑曲霉脂肪酶A(ANLA)展示于酵母细胞表面,在提高酶稳定性的同时,实现脂肪酶的表达、固定及纯化一体化、简单化。同时,考虑到有诸多因素影响着展示脂肪酶的活力,本研究在前期实验室筛选的酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1锚定蛋白的基础上,以毕赤酵母X-33(酿酒酵母存在过度糖基化现象)为宿主,探讨了不同连接序列和启动子对展示ANLA酶活力的影响,以期为开发性能良好的黑曲霉脂肪酶全细胞催化剂提供新的理论探讨和技术支持。主要研究工作和结果摘要如下:
　　1.以酵母细胞壁蛋白Sed1为锚定蛋白,在Sed1与ANLA之间插入不同的连接序列,构建六种基于不同连接序列的表面展示系统。经过筛选各获得1株酶活力较高的重组菌株,分别为X-33/pAOX-A0S89＃,X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pAOX-AS1S44＃,X-33/pAOX-AS2S32＃,X-33/pAOX-AS3S42＃,X-33/pAOX-AS4S62＃。采用Fisher法(α=0.05)对六株重组菌株的酶活力进行多重比较,结果显示X-33/pAOX-AGS44＃酶活最高,可达到24.96U/g干细胞,略大于X-33/pAOX-AS1S44＃酶活(22.74U/g干细胞),两者均显著大于其余四株重组菌株的酶活。利用流式细胞仪对六株重组菌株展示效率进行检测分析,X-33/pAOX-AGS44＃的展示率最高,达94.58％,而X-33/pAOX-AS1S44＃的展示率最低,仅为61.57%。上述结果表明,选用(G4S)3为连接序列构建的重组菌株X-33/pAOX-AGS44＃展示ANLA的效果最佳。展示ANLA的最适温度和最适pH分别为45°C,pH7.5,与游离酶一致,但稳定性有所提高。
　　2.构建诱导型表面展示载体pFLD-AGS和组成型表面展示载体pGAP-AGS,pTEF-AGS,分别将其电转入毕赤酵母X-33中,经筛选各获得1株酶活力较高的重组菌株,分别为X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃,X-33/pTEF-AGS77＃。对三株重组菌与之前获得的X-33/pAOX-AGS44＃酶活力进行多重比较分析,结果表明X-33/pAOX-AGS44＃与X-33/pFLD-AGS35＃之间酶活无显著差别,但显著大于另两株的酶活,而X-33/pTEF-AGS77＃酶活显著小于其它三株重组菌株。
　　3.分别对X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃的摇瓶发酵条件进行优化,在甲醇诱导时间为72h,初始pH为6.0,每24h甲醇添加量为1%,接种量为6%,装液量为50mL的条件下,X-33/pAOX-AGS44＃展示ANLA的酶活力最高可达到38.02U/g干细胞;在甲醇诱导时间为72h,初始pH为7.5,每24h甲醇添加量为2%,接种量为2%,装液量为40mL的条件下,X-33/pFLD-AGS35＃展示ANLA的酶活力可达30.46U/g干细胞;在以油酸作为碳源,氮源蛋白胨及酵母提取物浓度分别为4%,1%,初始pH为6.5,接种量为2%,装液量为50mL,培养时间为48h的条件下,X-33/pGAP-AGS19＃展示ANLA的酶活力达到27.06U/g干细胞。对三者优化后的酶活进行多重比较发现,X-33/pAOX-AGS44＃的酶活力显著高于另外两株重组菌株。上述结果表明,选用PAOX1调控融合蛋白的表达时,展示ANLA酶活力最高。