亮菌口服液液体深层发酵工艺的研究

亮菌学名假蜜环菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]，是一种大型的药食兼用型真菌。因菌丝体在暗处发出蓝色的荧光，故称之为亮菌。根据相关文献，该菌对于肝炎、胆囊炎、肿瘤以及放化疗引起的白细胞减少等炎症有一定的疗效，且还具有利肺、醒酒、益肠胃、强筋壮骨、疏风活络等保健功效。亮菌口服液是一款利用现代生物制药工艺将亮菌经培养发酵提取后制得的药品，内含有亮菌甲素、亮菌多糖以及氨基酸、多肽等多种生物活性物质。
　　目前国内亮菌口服液及胶囊等相关制剂多采用固体发酵的生产工艺。以玉米粉、红薯粉等为原料按一定比例混合制得固体培养基，灭菌接种，然后恒温避光培养两个月左右。此生产工艺优点是发酵程度深，利于多种药用有效成分的表达和积累;缺点是生产周期长，污染的概率大，且一旦染菌则只能全部作废，造成极大浪费，且发酵终了培养基中残糖浓度依然很高，既影响产品的下游提取工作也造成了原料的浪费。因此，固体发酵规模小、周期长、产能低的缺点严重制约了企业的产能和效益。合肥诚志生物制药有限公司在亮菌口服液的生产过程中发现随着亮菌传代次数的增加，菌种逐渐退化减产，降低了企业的产能和及药品的效价。本实验室希望能够找到一种延缓亮菌退化或使其复壮的简单易行的方法和技术。
　　针对合肥诚志生物制药有限公司提供的生产工艺和亮菌菌种，本实验室已开展了一系列研究。具体如下:(1)亮菌液体种子制备及其应用研究;(2)亮菌液体发酵初步研究;(3)亮菌固体发酵多糖提取工艺的优化;(4)现行工艺亮菌固体发酵条件改良。
　　在前期工作的基础上，本文对亮菌液体种子深层发酵和静置发酵两种发酵工艺进行初步研究，探究其取代传统的亮菌固体发酵方式的可行性，为亮菌口服液的液体种子发酵生产工艺技术提供参考;以及对亮菌菌种复壮方法进行初步的研究。
　　本论文主要内容:(1)亮菌液体种子深层发酵工艺的探究;(2)亮菌液体种子静置发酵工艺的探究;(3)发酵液组分的剖析;(4)退化亮菌菌种复壮的初步研究。研究结果为:
　　(1)亮菌液体种子深层发酵工艺的研究结果:通过14 L小型发酵罐液体深层发酵对亮菌液态种子发酵工艺进行优化探究。采用28℃，通气量为1∶1 v/v·m，200 r/min，培养一周，得亮菌干重16.55 g/L，其中菌丝体中亮菌多糖含量为5.42％，蛋白含量为1.75％。结果表明，通过发酵罐液体种子深层发酵方式所获得的亮菌生物量高，且周期短，但缺点是发酵程度低，发酵液颜色不深，无法像固体发酵那样产生菌丝体分泌大量棕褐色液体的现象。
　　(2)亮菌液体种子静置发酵工艺的研究结果:液体静置发酵采用500ml三角瓶，28℃，150r/min，摇瓶3天后静置发酵14天，亮菌干重为10.69g/L，发酵液中亮菌多糖含量为1.016g/L，蛋白含量为0.320g/L。观察发现每一个三角瓶都能分泌大量棕褐色胞外液且形成粗壮多分支的菌索，相对于传统的固体发酵，这大大缩短了发酵周期，且发酵液质量高，杂质少，提取浓缩简单易行，亮菌多糖等活性成分指标均优于传统的固体发酵。
　　(3)发酵液组分的分析研究结果:虽然静置发酵得到的亮菌生物量不及发酵罐液体深层发酵，但后者的发酵程度深，能够产生菌丝体分泌大量棕褐色胞外液的现象，培养基利用率高，优于传统的固体发酵。对液体静置发酵工艺进一步研究发现其发酵液中亮菌甲素含量可达3.118mg/L。
　　(4)亮菌菌种复壮的初步研究结果:通过在普通的培养亮菌的PDA固体培养基中分别添加不同浓度柳木屑提取液、稻草提取液和不同种类的微量元素，探索其对亮菌菌种的复壮效果高低，初步研究发现亮菌在添加了稻草提取液的PDA固体培养基上生长旺盛，复壮效果明显。进一步研究发现添加1％浓度稻草提取液对亮菌复壮效果最明显。
　　静置发酵法不仅在发酵成本方面优于发酵罐液体深层发酵法，而且静置发酵法操作简便，可以取代传统的固态发酵工艺;以及在PDA固体培养基中添加稻草提取液对亮菌菌种进行复壮的研究，为合肥诚志生物制药有限公司生产亮菌口服液相关工艺的优化和改进提供参考，具有一定的实践和应用价值。