异牛肝菌素对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究

目的:恶性肝脏肿瘤是导致死亡的主要原因之一。据统计，在亚洲，肝癌的发病率是最高的，尤其是在中国和日本。在中国，每年10万人中就有50人罹患此病。目前，中国肝癌是第二位引起癌症死亡的病因。传统的手术切除，并辅助以放疗、化疗等手段依然是主要的治疗措施。目前，临床上用的化疗药物在杀死癌细胞的同时，也杀死了正常的细胞和淋巴细胞，给患者造成了很大痛苦，因此，寻找高效、低毒的药物是摆在我们每位医务工作者面前的艰巨任务。来自植物和大型真菌的天然代谢产物是这类药物的首选。
　　异牛肝菌素(iso-suillin)是从褐环粘盖牛肝菌（Suillus luteus）子实体中分离纯化得到的一种化合物，相对分子量为440.29，化学名为3，6-二羟基-[(2E，6E，10E)-3，7，11，15-六甲基十六碳-2，6，10，14-四烯]苯乙酯，属于聚异戊二烯酚类化合物，是粘盖牛肝菌素suillin的同分异构体。初步研究结果显示，iso-suillin具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性。本论文主要研究了iso-suillin对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制。
　　方法:
　　1.细胞培养SMMC-7721细胞以RPMI1640培养基培养，内含10％胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL，置饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱培养。
　　2.MTT法检测细胞体外增殖活性不同浓度的iso-suillin(0，1.5，3，6，12，24μM)分别作用于对数生长期的人SMMC-7721细胞24 h、48 h和72 h，应用四甲基偶氮唑蓝(Methy thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法测定细胞光密度值(Optical density，OD)，计算生长抑制率和半数抑制浓度(IC50)，做出生长曲线柱形图，从而筛选iso-suillin对SMMC-7721细胞的作用浓度。然后取不同浓度的iso-suillin、顺铂、5-氟尿嘧啶分别作用于SMMC-7721细胞培养48 h，检测三种药物对细胞增殖的影响;最后取不同浓度的iso-suillin、顺铂作用于人淋巴细胞24 h，检测其对正常人淋巴细胞的影响。以1.0×104/mL细胞浓度接种于96孔培养板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。定时检测细胞生长情况，每孔加入5 mg/mL MTT20μl，继续孵育4h，离心吸去上清，然后每孔加入150μl二甲基亚砜(Dimethyl-sulfoxide，DMSO)。用酶标仪测490 nm波长吸光值（A值），每组设8个复孔，根据公式计算细胞活性，细胞活性=[1-（对照组A-实验组A）/对照组A]×100％，取其平均值并绘制细胞活性柱形图。
　　3.流式细胞术检测细胞周期和凋亡率将处于对数生长期的SMMC-7721细胞制成单细胞悬液，PBS冲洗2遍后用70％酒精固定，分别用EB和Annexin V-FITC/PI进行荧光染色15 min后进行流式细胞分析。计算出G0/G1、S、G2/M期及早期和晚期凋亡分布百分比。
　　4.克隆形成实验SMMC-7721细胞加入不同浓度的iso-suillin处理48 h，后将悬浮的细胞以每孔200个细胞重新种在6孔板上。培养2周后，用4％的多聚甲醛固定，结晶紫染色，以可见菌落（大于50个细胞）计数，然后用Nikon相机拍照记录。
　　5.细胞形态学观察SMMC-7721细胞种于6孔板后用不同浓度的iso-suillin处理48 h。细胞用DAPI(DAPI[Sigma，USA])染色，荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)记录其细胞形态。凋亡形态学检测在河北医科大学电镜室完成(H-7500，Hitachi)。
　　6.线粒体膜电位检测取5 mL对数生长期的SMMC-7721细胞，以1×105个/mL浓度接种于细胞培养瓶中，实验组加入1 mL无血清的RPMI1640培养基稀释的iso-suillin，使其终浓度为1.4μM、2.8μM、5.6μM，对照组加入1 mL无血清培养基，置于CO2培养箱中37℃培养48 h，然后收集细胞。用PBS液漂洗2次后，加入罗丹明123染色液，使其终浓度为10μg/mL，常温避光染色15 min，膜电位检测在河北医科大学第四附属医院完成(Epics-XLⅡ,Beckman Coulter, USA)。
　　7.蛋白印记检测相关蛋白表达收集细胞→冷PBS洗涤→提取细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜转移→5％脱脂奶粉封闭，室温1.5～2 h→结合一抗4℃过夜→TBS-T（含0.05％ Tween-20的TBS）洗3次，5～10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG室温反应1～2 h→TBS-T洗3次，5～10 min/次→ECL显影，并用凝胶图像分析系统测定并计算各蛋白条带的积分光密度同对应的β-actin积分光密度比值。
　　8.统计学方法实验结果以(x)±s表示，用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析(One-Way ANOVA)，取P＜0.05为有显著性意义。
　　结果:
　　1.Iso-suillin对SMMC-7721增殖的影响SMMC-7721细胞在iso-suillin处理后体外培养24、48和72 h后，其吸光度值降低，IC50分别为26.1μM、2.4μM、1.2μM，细胞活性显示其体外增殖能力下降;与临床上常用的化疗药物顺铂和5-FU处理细胞48 h后相比，虽三种药物都对细胞活性产生明显的抑制效果，但iso-suillin的抑制效果明显高于顺铂和5-氟尿嘧啶;iso-suillin对正常人淋巴细胞没有明显的抑制作用。
　　2.Iso-suillin对SMMC-7721细胞周期分布及凋亡率的影响SMMC-7721细胞经0μM、1.2μM、2.8μM和5.6μM iso-suillin处理48 h后，细胞的G0/G1期细胞比例为51±2.00％、64.03±3.00％、69.53±0.97％及73.64±1.06％;S期细胞分别为26.07±2.18％、17.30±1.30％、14.67±1.54％、11.2±0.98％;G2/M期细胞分别为22.93±0.59％、18.67±1.86％、15.80±2.39％、15.20±1.35％。SMMC-7721细胞主要表现为G0/G1期细胞增多，存在G0/G1期阻滞(P＜0.05); SMMC-7721细胞早期凋亡比例为1.27±0.12％、3.61±0.15％、4.79±0.08％、2.41±0.08％，晚期凋亡比例为3.85±0.44％、35.64±1.73％、38.82±0.72％、46.76±0.97％，早期凋亡较对照组升高，且有明显差异(P＜0.05）;晚期凋亡较对照组升高明显，且有明显差异(P＜0.05）。
　　3.Iso-suillin影响SMMC-7721细胞克隆形成SMMC-7721细胞经0μM、1.2μM、2.8μM和5.6μM iso-suillin处理48 h后每个培养皿中平均克隆形成的细胞数分别为100±0、77.33±8.02、49.33±7.09和26.67±9.61。iso-suillin处理后的细胞克隆菌落数量明显少于对照组细胞(P＜0.05)，且呈剂量依赖性，组间比较有明显差异性(P＜0.05)。
　　4.Iso-suillin对SMMC-7721细胞形态的影响DAPI荧光染色观察细胞凋亡的形态特征:对照组中的细胞核界限清晰可见，多呈圆形或者椭圆形，内部可见均匀的蓝色荧光，染色质分布均匀;iso-suillin处理后的细胞，部分细胞核缩小，染色质分布不均，出现凝集，可见颗粒团状分布，核碎裂形成许多球形颗粒物质。电镜检测细胞凋亡的形态特征:对照组细胞内结构清晰，细胞核和细胞器的结构清晰易辨;iso-suillin处理后的细胞可见染色质固缩并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月状或环状小体，细胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成一个个空泡，线粒体结构无明显改变。
　　5.Iso-suillin影响SMMC-7721细胞线粒体膜电位流式细胞术检测罗丹明-123染色iso-suillin处理48 h后的SMMC-7721细胞，对照组及1.2μM、2.8μM和5.6μM iso-suillin处理组中被罗丹明123染色的线粒体膜电位可通过公式1g(X-Mode)×340计算，随着浓度增加，线粒体膜电位分别为193.94±4.26、117.56±9.09、108.58±7.41、88.07±9.45。由此可见，线粒体膜电位的丧失与药物浓度呈量效关系，随药物浓度升高而降低。
　　6.Iso-suillin对SMMC-7721细胞周期及凋亡相关蛋白的影响SMMC-7721细胞经0μM、1.2μM、2.8μM和5.6μM iso-suillin处理48 h后，Caspase-3蛋白的IOD比值分别为:0.53±0.03、1.14±0.16、1.66±0.33和1.43±0.02;Caspase-8蛋白的IOD比值分别为1.11±0.13、1.22±0.09、1.34±0.20和1.59±0.56; Caspase-9蛋白的IOD比值分别为1.22±0.11、1.21±0.01、1.44±0.21和1.79±0.06;细胞色素C蛋白的IOD比值分别为:0.13±0.01、0.16±0.01、0.18±0.02和0.89±0.03;FADD蛋白的IOD比值分别为:0.14±0.01、0.21±0.04、0.22±0.18和0.32±0.01; p53蛋白的IOD比值分别为0.87±0.01、1.26±0.16、1.82±0.34和1.56±0.45; p21蛋白的IOD比值分别为0.14±0.01、0.16±0.02、0.21±0.01和0.87±0.30; p-Rb蛋白的IOD比值分别为1.64±0.07、1.41±0.10、1.46±0.47和0.94±0.06; E2F-1蛋白的IOD比值分别为1.22±0.14、0.44±0.01、0.42±0.04和0.31±0.04; CDK2蛋白的IOD比值分别为1.03±0.03、0.98±0.05、0.80±0.07和0.59±0.09; CDK4蛋白的IOD比值分别为3.39±0.38、2.30±0.41、1.26±0.28和1.00±0.09;CyclinE1蛋白的IOD比值分别为0.87±0.11、0.25±0.03、0.24±0.01和0.23±0.02; CyclinD1蛋白的IOD比值分别为0.91±0.04、0.78±0.04、0.73±0.01和0.74±0.02。结果显示:与对照组细胞相比，经iso-suillin处理后细胞中Caspase-3、-8、-9、细胞色素C、FADD、p53、p21蛋白表达增高(P＜0.05); p-RB、E2F-1、CyclinE1、CyclinD1、CDK2、CDK4蛋白表达降低(P＜0.05），与对照组细胞相比有明显差异性（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.Iso-suillin可抑制SMMC-7721细胞的活性和增殖能力，而对正常的人淋巴细胞没有抑制作用。
　　2.Iso-suillin可诱导SMMC-7721细胞发生凋亡。
　　3.Iso-suillin诱导SMMC-7721细胞G0/G1期阻滞。
　　4.Iso-suillin诱导的SMMC-7721细胞G0/G1期阻滞，可能通过激活p53/p21细胞周期蛋白cyclin E1、cyclinD1，周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4途径实现。
　　5.Iso-suillin通过死亡受体途径和线粒体途径SMMC-7721细胞凋亡。