高糖或缺氧对原代心肌细胞Nkx2-5、Tbx5表达的影响

目的:心脏是胚胎发育过程中第一个形成的器官，作为高度特化的器官，一直被认为没有再生的能力，受损后以瘢痕修复为主替代之，严重影响心肌收缩功能，是不可逆心衰的病理基础。但在2011年Porrello等人手术切除1日龄小鼠15％的心室肌，21天后小鼠心脏完全再生且功能正常无瘢痕形成，证明哺乳动物心肌有再生能力;2013年Senyo等人证实哺乳动物预先存在的心肌细胞是维持心肌日常更替和受损后心肌再生的主要细胞来源。
　　Nkx2-5与其下游基因Tbx5是心脏发育早期转录因子，是心肌前体细胞的标志基因，在功能上紧密关联。Nkx2-5、Tbx5随着心脏发育成熟表达逐渐降低维持低水平状态。研究发现Nkx2-5、Tbx5表达升高与心肌再生相关。因此Nkx2-5、Tbx5表达升高是参与心肌再生的重要因素。
　　高糖或缺氧是临床常见心肌受损因素，可导致心肌肥大和心肌纤维化，最终造成心脏功能不可逆损伤。高糖缺氧与损伤之间的关系认识清楚，但高糖缺氧与心肌再生的关系没有明确的认识。高糖或缺氧能否刺激心肌细胞早期转录因子Nkx2-5、Tbx5表达上调参与心肌细胞再生未有报道。
　　高糖缺氧均可刺激诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)活性增强，iNOS催化底物可以大量生成一氧化氮(NO)，过量NO和超氧阴离子迅速反应生成的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)是已知氧化活性最强的一类物质，也是体内造成氧化应激损伤的重要原因。那么，高糖缺氧刺激心肌细胞不同时间后iNOS、Nkx2-5、Tbx5表达如何变化？ONOO-水平是否影响Nkx2-5、Tbx5表达未见报道。
　　通心络是国药准字中药复方制剂，是临床用于治疗心脏疾病的常用药物。不同浓度通心络干预高糖或缺氧刺激的原代心肌细胞是否影响iNOS、Nkx2-5、Tbx5表达未见研究。
　　本实验旨在探讨高糖或缺氧能否使原代心肌细胞Nkx2-5、Tbx5基因表达上调;ONOO-水平是否是影响Nkx2-5、Tbx5表达的重要机制;不同浓度通心络的干预作用。
　　本实验采用出生3天以内SD大鼠乳鼠原代培养心肌细胞。免疫荧光法鉴定心肌细胞。检测高糖或缺氧刺激原代心肌细胞不同时间iNOS、Nkx2-5、Tbx5基因的表达;不同浓度的通心络干预高糖或缺氧刺激的原代心肌细胞，检测iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因表达;应用ONOO-的供体(SIN-1)和清除剂(FeTTPs)，检测ONOO-对Nkx2-5、Tbx5基因表达影响。
　　方法:
　　1.原代心肌细胞分离及培养取出生3天以内的SD大鼠乳鼠7-8只，75％酒精消毒，用眼科剪在胸骨角上2肋剪开胸腔，轻挤胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏，将取下的心脏剪碎，用胰酶少量多次消化组织块，采用物理和化学方法去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。用含15％胎牛血清的DMEM（低糖）的培养基接种于六孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养，培养7天用以实验。
　　2.分组
　　实验分为高糖组和缺氧组，应用25mM的DMEM培养基模拟高糖环境，应用终浓度为100uM的氯化钴模拟缺氧环境;
　　(1)检测细胞在高糖刺激下不同时间iNOS，Nkx2-5，Tbx5转录水平，将细胞分为正常组（即0h组）、高糖刺激1h、2h、3h、4h、5h组。
　　(2)检测ONOO-水平对Nkx2-5，Tbx5转录水平的影响，将细胞分为正常组，高糖组，高糖+铁卟啉组，SIN-1组。
　　(3)检测不同浓度通心络在高糖刺激下对心肌细胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为高糖组，通心络360μg/ml组、通心络540μg/ml组、通心络720μg/ml组。
　　(4)检测细胞在缺氧刺激下不同时间iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平，将细胞分为正常组（即0h组），缺氧1h、2h、3h、4h、5h组。
　　(5)检测ONOO-水平对Nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为正常组，缺氧组，缺氧+铁卟啉组，SIN-1组。
　　(6)检测不同浓度通心络在缺氧刺激下对心肌细胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为缺氧组，通心络360μg/ml组、通心络540μg/ml组、通心络720μg/ml组。
　　3.形态学观察
　　刚提取的心肌细胞为球形，12小时之后细胞基本贴壁，细胞逐渐伸出伪足，细胞与细胞之间逐渐建立联系;48小时细胞逐渐出现跳动，细胞渐渐成片跳动，跳动频率一致。
　　4.利用免疫荧光的方法检测提取细胞中cTNT表达，鉴定心肌细胞5心肌细胞通过不同刺激培养后，检测心肌细胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因转录水平。
　　Trizol一步法提取心肌细胞中总RNA;用β-actin做内参，RT-PCR方法检测iNOS、Nkx2-5、Tbx5的mRNA表达。
　　结果:
　　1.原代心肌细胞的分离纯化及培养采用胰酶消化法，首先将心脏剪碎，胰酶消化心肌组织块，成功分离为单个心肌细胞;运用差速贴壁法及化学方法除去成纤维细胞，纯化心肌细胞;高糖DMEM培养心肌细胞，相差显微镜下观察刚取的心肌细胞为球形、透亮、有立体感，且成活率高、存活时间长，细胞贴壁后逐渐伸出伪足建立细胞之间的联系，48小时候细胞出现跳动，并且逐渐成片跳动，频率一致;利用免疫荧光检测到心肌细胞中表达心肌细胞特异蛋白cTnT，提示原代心肌细胞培养成功。
　　2.1 心肌细胞在高糖刺激下培养0h、1h、2h、3h、4h、5h后检测心肌细胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的变化。
　　2.1.1 高糖刺激心肌细胞后iNOS的表达量与0h（0.0198±0.0023）相比，1h(0.1511±0.0078, P＜0.01)、2h(0.2193±0.0300, P＜0.01)、3h(0.1370±0.0079, P＜0.01)、4h(0.0792±0.0106, P＜0.05)、5h(0.1076±0.0102,P＜0.01)均显著升高;
　　2.1.2 高糖刺激心肌细胞后Nkx2-5的表达量与0h相比，1h(0.0899±0.3012)无差异，2h（5.0721±0.3238，P＜0.01）、3h（3.9528±0.4833，P＜0.01）、4h（3.6183±0.4822，P＜0.01）、5h（3.3206±0.3590，P＜0.01）显著升高;
　　2.1.3 高糖刺激心肌细胞后Tbx5的表达量与0h相比，1h(2.4470±0.2681，P＜0.01)、2h(6.8240±0.3612, P＜0.01)、3h(3.3203±0.3412, P＜0.01)、4h（3.0649±0.3478，P＜0.01）、5h（2.4626±0.3227，P＜0.01）均显著升高;
　　2.2 升高或降低ONOO-水平，检测正常组、高糖组、高糖+铁卟啉培组，SIN-1组Nkx2-5、Tbx5转录水平的变化。
　　2.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌细胞Nkx2-5的表达量与正常组相比，高糖组（7.8980±1.3253，P＜0.01）升高，高糖+铁卟啉组（3.2280±0.8611）无显著变化，SIN-1组（6.8342±0.3039，P＜0.01）升高;
　　2.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌细胞Tbx5的表达量与正常组相比，高糖组（5.6467±0.3538，P＜0.01）升高，高糖+铁卟啉组（1.4675±0.2194）无明显变化，SIN-1组（5.7920±0.1311，P＜0.01）升高;
　　2.3 心肌细胞在高糖刺激下同时用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心络，分别干预后检测iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的变化。
　　2.3.1 通心络干预高糖刺激的心肌细胞iNOS的表达量与对照组（0.1697±0.0128）相比，360μg/ml组（0.1666±0.0318）无明显变化，540μg/ml组（0.0908±0.0090，P＜0.01）、720μg/ml组（0.1182±0.0140，P＜0.05）显著降低;
　　2.3.2 通心络干预高糖刺激的心肌细胞Nkx2-5的表达量与对照组（0.0436±0.0038）相比，360μg/ml组（0.0452±0.0031）无明显变化，540μg/ml组（0.0255±0.0013，P＜0.01）、720μg/ml组（0.0313±0.0025，P＜0.05）显著降低;
　　2.3.3 通心络干预高糖刺激的心肌细胞Tbx5的表达量与对照组（0.1287±0.0253）相比，360μg/ml组（0.1087±0.0197）无明显变化，540μg/ml组（0.0342±0.0040，P＜0.01）、720μg/ml组（0.0481±0.0059，P＜0.05）显著降低;
　　3.1 心肌细胞在缺氧刺激下培养0h、1h、2h、3h、4h、5h后检测心肌细胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的变化。
　　3.1.1 缺氧刺激心肌细胞后iNOS的表达量与0h（0.0541±0.0071）相比，1h(0.3834±0.0468, P＜0.01)、2h(0.0282±0.0216, P＜0.01)、3h（0.1534±0.0139，P＜0.05）显著升高，4h（0.0745±0.0154）、5h（0.0679±0.0145）无明显变化;
　　3.1.2 缺氧刺激心肌细胞后Nkx2-5的表达量与0h（0.0356±0.0050）相比，1h(0.1929±0.0186, P＜0.01)、2h(0.1191±0.0142, P＜0.01)、3h（0.0888±0.0124，P＜0.05）显著升高，4h（0.0396±0.0063）、5h(0.0328±0.0021)无明显变化;
　　3.1.3 缺氧刺激心肌细胞后Tbx5的表达量与0h（0.1339±0.0059）相比，1h（0.3750±0.0173，P＜0.01）、2h（0.2353±0.0135，P＜0.01）显著升高，3h（0.1413±0.0134）、4h（0.1556±0.0055）、5h(0.1767±0.0249)无明显变化;
　　3.2 升高或降低ONOO-水平，检测正常组，缺氧组，缺氧+铁卟啉组，SIN-1组Nkx2-5，Tbx5转录水平的变化。
　　3.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌细胞Nkx2-5的表达量与正常组相比，缺氧组（5.4382±0.4141，P＜0.01）升高，缺氧+铁卟啉组（1.7654±0.4388）无显著变化，SIN-1组（5.3441±0.1602，P＜0.01）升高;
　　3.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌细胞Tbx5的表达量与正常组相比，缺氧组（7.4372±0.5549，P＜0.01）升高，缺氧+铁卟啉组（1.4635±0.1315）无显著变化，SIN-1组（6.0329±0.3361，P＜0.01）升高;
　　3.3 心肌细胞在缺氧刺激下同时用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心络，分别干预后检测iNOS、Nkx2-5、Tbx5转录水平的变化。
　　3.3.1 通心络干预缺氧刺激的心肌细胞iNOS的表达量与对照组（0.0263±0.0022）相比，360μg/ml组（0.0271±0.0019）无明显变化，540μg/ml组（0.0133±0.0010，P＜0.01）、720μg/ml组（0.0112±0.0013，P＜0.01）显著降低;
　　3.3.2 通心络干预缺氧刺激的心肌细胞Nkx2-5的表达量与对照组（0.0213±0.0013）相比，360μg/ml组（0.0204±0.0019）无明显变化，540μg/ml组（0.0134±0.0019，P＜0.05）、720μg/ml组（0.0113±0.0017，P＜0.01）显著降低;
　　3.3.3 通心络干预缺氧刺激的心肌细胞Tbx5的表达量与对照组（0.0333±0.0029）相比，360μg/ml组(0.0310±0.0021)、540μg/ml组（0.0307±0.0025）无明显变化、720μg/ml组（0.0158±0.0008，P＜0.01）显著降低;
　　结论:
　　1.高糖或缺氧可以使原代心肌细胞早期转录因子Nkx2-5、Tbx5表达升高。
　　2.高糖或缺氧引起的iNOS变化与Nkx2-5、Tbx5变化一致，ONOO-影响Nkx2-5、Tbx5基因表达，ONOO-可能是引起早期转录因子Nkx2-5、Tbx5表达升高的重要机制之一。
　　3.540μg/ml组通心络，对高糖刺激的心肌细胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5表达抑制效果最强;720μg/ml组通心络，对缺氧刺激的心肌细胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5表达抑制效果最强。