自噬在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠神经元退行性变中的作用及机制探讨

目的:多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统（central nervous system，CNS）自动免疫性疾病，神经退行性变与炎性脱髓鞘均为其重要病理特征。多发性硬化疾病早期阶段开始出现神经元退行性变，是多发性硬化病人神经功能持续、进行性损害的主要原因。多发性硬化神经元退行性变的病理机制迄今未明，与炎症、氧化应激、轴浆内Ca2+聚集、谷氨酸兴奋毒性、线粒体失功能、蛋白聚集和碳素化等多种机制有关。
　　自噬是将细胞内多余或受损的细胞器、折叠蛋白和侵入的病原体运送至溶酶体进行消化降解的通路。自噬对T细胞具有前存活和前死亡双重作用，是免疫和炎症重要介导者。同时，自噬在维持神经元稳态中发挥着重要作用，参与多种神经退行性疾病的发病机制，如阿尔茨海默病、Huntington's病、帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。最近实验研究显示，多发性硬化病人和EAE小鼠T细胞及脑组织自噬相关基因5(autophagyassociated gene，Atg5)水平明显升高，这提示自噬与多发性硬化病理存在某种特定的联系。但是，自噬在多发性硬化神经退行性病变的作用未见相关报道。
　　目前认为，调节自噬活性是神经退行性疾病潜在且颇具前景的治疗手段。雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target ofrapamycin，mTOR)抑制剂和最为经典的自噬药理诱导剂，经证实可以有效缓解多发性硬化病人和EAE模型小鼠病情，然而是否减轻神经元退行性变未见相关报道。目前多发性硬化的治疗主要是针对抗炎和免疫调节，这些治疗可以有效缓解多发性硬化急性期病情，但不能改善继发的长期进行性神经功能缺失。深入研究自噬在多发性硬化神经元退行性变的发病机制为制定新的有效治疗策略奠定基础。
　　实验性脑脊髓膜炎小鼠模型(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)是研究多发性硬化神经元退行性变的理想模型。本实验观察自噬活性的时序表达和调节通路的活性改变，以及自噬诱导剂雷帕霉素在EAE神经元损伤的效果，旨在初步探讨自噬与多发性硬化神经退行性变发病机制中的可能联系，为多发性硬化治疗寻找新靶点。
　　方法:
　　1.实验材料
　　雌性C57BL/6纯系小鼠，鼠龄6-8周，体重18-20 g，购自维通利华实验动物技术有限公司（北京，中国）。小鼠饲养于室温(24±2℃)无菌环境中，维持光与暗12小时交替循环，提供足够的食物和洁净水。所有动物实验经由河北医科大学实验动物管理和使用委员会和当地实验伦理委员会批准。
　　2.EA模型的建立和评价将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成5mg/ml，并按1∶1等体积加入CFA，加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为4mg/ml，充分混合乳化。乳化后按每只0.1ml于C57BL/6小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，第0h及第48h腹腔注射0.5ml PTX（500ng/只）。免疫当天起采用国际通用的5分制法对实验小鼠进行神经功能评估，具体评分标准如下:0分无症状;1分尾部失去张力;2分后肢力弱;3分后肢瘫痪;4分后肢及前肢瘫痪;5分濒临死亡或死亡。当临床症状介于两个评分之间时以较低分数加0.5分表示。
　　3.实验分组及治疗为了研究EAE小鼠脊髓自噬活性的时序变化，C57BL/6小鼠被随机分成数目相同的两组:空白对照组和EAE模型组。每组又根据免疫后不同时期分成鼠龄匹配的三个亚组:发病前期组（13天）、发病高峰期组(20天)和发病晚期组(30d)。
　　为了研究自噬诱导剂雷帕霉素对EAE小鼠神经元的影响，C57BL/6小鼠被随机分成数目相同的三组:空白对照组（Control）、实验对照组（EAE-Vehicle）、雷帕霉素治疗组(EAE-Rapamycin)。雷帕霉素治疗组自免疫当日起腹腔注射雷帕霉素(Sigma)(1mg/kg)，每日一次。实验对照组小鼠自免疫当日起每日腹腔注射等量的灭菌水，每日一次。治疗至疾病高峰期处死小鼠。
　　4.自噬流分析
　　为了分析EAE小鼠脊髓自噬流导向，C57BL/6小鼠被随机分成数目相同的4组:空白对照组（正常小鼠+溶剂）、氯喹组（正常小鼠+氯喹）、EAE模型对照组（EAE模型小鼠+溶剂）、氯喹-EAE模型治疗组（EAE模型小鼠+氯喹）。每个亚组各5只小鼠。各组小鼠自EAE发病起（临床症状≥1.0）腹腔注射溶剂（0.1ml生理盐水）或氯喹(Sigma-Aldrich，Milano，Italy)(60mg/kg)，每日一次，连续给药7天。通过比较氯喹存在和缺失情况下LC3-Ⅱ蛋白水平的不同来确定EAE小鼠脊髓自噬流导向。
　　5.Nissl染色免疫后第17-21天，每组各取5只小鼠，经水合氯醛麻醉后，4％多聚甲醛灌流，取脊髓腰骶段石蜡包埋，5μm连续切片，进行Nissl染色和TUNEL染色。切片脱蜡至水后依次经过焦油坚牢紫水溶液浸染，蒸馏水冲洗，95％酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片保存。按照下列标准计算运动神经元数目:(1)位于脊髓前角腹侧至中央管腹侧末端连线之间区域的神经元;(2)20微米或以上直径的神经元;和(3)不同的核仁神经元。
　　6.免疫荧光染色和共聚焦显微镜免疫后20d的腰髓标本经4％多聚甲醛固定后制作成厚度为30um的冰冻切片。切片用0.01M PBS清洗，5分钟×3次。切片用0.01M PBS清洗，10分钟×3次。接下来用0.3％Triton(X)-100打孔约20分钟，之后用10％马血清封闭1小时，再浸在加有相应一抗的96孔板中孵育，4℃摇床过夜。次日，用0.01M PBS洗5分钟×3次，之后避光浸于已加入相应二抗的96孔板中孵育1小时，再次0.01M PBS洗3次，蒸馏水中浸泡数秒钟，放于擦净的载玻片上，避光晾干，之后滴一滴淬灭剂，封片。
　　7.TUNEL染色神经细胞凋亡是由末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)(Roche，Mannheim，Germany)测定。参照TUNEL试剂盒说明书，脊髓组织切片经过TUNEL反应液、Alexa fluor568-共轭-鬼笔环肽、DAPI染色。组织切片在Olympus显微镜(Olympus BX51，Tokyo，Japan)下观察。计算在15随机选择的视野TUNEL阳性细胞核的平均值，并以视野内标记的细胞核的百分数表示。
　　8.Western blot分析从脊髓腰膨大中提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度上样、电泳，浓缩胶:80V;分离胶:100V，直到所需marker条带跑完后停止电泳。电泳结束后使用转移电泳装置，在4℃100V恒压条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液（含5％脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭PVDF膜1h。一抗孵育:封闭液稀释p-AKT、ATK、 p-p70S6K、p70S6K、LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2、Bax和GAPDH抗体，与封闭好的PVDF膜4℃过夜。二抗孵育:用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h。加ECL、曝光、显影、定影。
　　9.统计方法
　　采用SPSS13.0软件进行统计分析，各项指标以均数±标准差表示（(x)±s）;临床神经功能评分资料应用Mann-Whitney U检验;其余计量资料均数的两组间比较应用ANOVA方差分析。p＜0.05具有统计学意义。
　　结果:
　　1.与空白对照组对比，C57BL/6小鼠脊髓LC3-Ⅱ蛋白水平在免疫后各个时间点（13天、20天、30天）均上调，免疫后20天最为显著，30天时降低。EAE小鼠脊髓Beclin1蛋白水平的时序变化与LC3-Ⅱ相反。与空白对照组比较，免疫后13天EAE小鼠脊髓Beclin1蛋白水平下调，免疫后20天降至最低点，免疫后30天回升至空白对照组水平。
　　疾病高峰期（约免疫后20天作用），氯喹-空白对照组与溶剂-空白对照组相比，小鼠脊髓LC3-Ⅱ水平升高。而EAE-溶剂对照组和EAE-氯喹治疗组LC3-Ⅱ水平无显著差异。
　　2.在疾病高峰期，EAE小鼠腰膨大节段，LC3主要定位于神经元，其次为少突胶质细胞，很少定位于星形胶质细胞。与鼠龄匹配的正常对照组相比，EAE小鼠LC3与NeuN荧光共定位现象明显增多。
　　3.免疫后13天EAE小鼠脊髓p-Akt(Ser473)水平轻度减少，免疫后20天其磷酸化水平明显升高，免疫后30天有所回落。p-p70S6K(Thr389)时序性变化与p-Akt水平基本一致。而总Akt和p70S6K无显著改变。雷帕霉素治疗导致EAE小鼠脊髓LC3-Ⅱ蛋白水平以及Beclin1蛋白水平显著增加，磷酸化Akt和p70S6K水平降低。
　　4.雷帕霉素治疗组可以延迟小鼠疾病症状发生的时间，但无明显差别。发病高峰期和发病晚期雷帕霉素均可明显减轻神经功能评分。与空白对照组比较，实验对照组和雷帕霉素治疗组Nissl染色阳性神经元数目和NeuN染色阳性神经元数目减少。雷帕霉素治疗组较实验对照组Nissl染色阳性神经元和NeuN-阳性神经元增多。
　　5.与实验对照组比较，在EAE发病高峰期，雷帕霉素治疗组小鼠前凋亡蛋白Bax水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平上调，Bax/Bcl-2比值上升。与空白对照组相比，实验对照组和雷帕霉素治疗组小鼠脊髓腰膨大节段TUNEL-阳性凋亡细胞明显增多。而与实验对照组比较，雷帕霉素治疗组脊髓腰膨大TUNEL阳性细胞数量略有减少，统计学无显著差异。与westernblot结果一致，免疫荧光共聚焦显示雷帕霉素治疗小鼠比实验对照组小鼠脊髓bcl-2阳性神经元明显增多，统计学有显著差异。
　　结论:
　　1.EAE小鼠脊髓自噬流受损导致自噬小体降解阻滞、聚集于神经元，提示自噬缺陷可能是EAE小鼠神经元退行性变的发病机制之一。
　　2.Akt/mTOR/p70S6K信号转导通路参与介导EAE小鼠自噬活性，而雷帕霉素通过抑制该通路能够有效恢复EAE小鼠脊髓自噬活性。
　　3.雷帕霉素能够明显缓解EAE小鼠急性期神经功能缺失症状，减轻脊髓神经元损伤。其原因可能与雷帕霉素通过诱导自噬促进神经元聚集的蛋白质清除，抑制Bax-依赖的凋亡、抗炎等综合作用的结果。
　　4.雷帕霉素即具有强大的抗炎、抑制免疫作用，又有神经保护作用，是理想的治疗多发性硬化的药物。