PLCε1基因在食管癌发生、进展中的作用及机制研究

食管癌是常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌的高发国家，食管癌在肿瘤的死亡率中排名第四。河北省磁县是食管癌高发区，食管癌的发病率和死亡率均排名在所有肿瘤的首位，严重威胁着人们的健康。
　　食管癌的发生是环境因素和遗传因素长期相互作用的结果。在河北省磁县，食管癌的发生存在家族聚集现象提示遗传背景在食管癌的发生中发挥重要作用。我们前期对候选基因的研究已经识别了一些与磁县人群食管癌遗传易感性相关的单核苷酸多态性位点(single nucleotidepolymorphism，SNP)。但是迄今为止，食管癌易感性的遗传基础仍不太明确。全基因组关联研究采用高通量的基因分型技术，可以同时对成千上万个SNP位点进行分析，而不需要预先选定候选基因，因此可能是没有偏倚的研究。三个全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)先后报道PLCε1基因rs2274223 A/G SNP与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的发病风险相关。随后，这一结果在中国东部食管癌低发人群中得到证实。目前，这个SNP位点是否可以作为预测中国北方食管癌高发区人群ESCC发病风险的标志物尚未见报道。另外，rs11599672 T/G SNP位于PLCε1基因转录因子的结合位点，T→G的颠换可能导致PLCε1基因转录活性和表达水平的改变。研究表明，PLCε1基因rs11599672 T/G SNP可影响非西班牙白人吸烟、饮酒相关的非口咽部头颈鳞状细胞癌遗传易感性。Rs11599672 T/G SNP是否影响中国北方食管癌高发区人群ESCC的遗传易感性尚未见报道。
　　PLCε1作为Ras原癌基因的效应子，其在肿瘤发生和进展的作用已有较为广泛的研究。PLCε1在肿瘤的发生中发挥促进或抑制作用。在化学致癌物诱导鼠皮肤肿瘤发生的过程中，PLCε1发挥促进作用。随后的研究表明，PLCε1的促进作用可能归因于其扩大了炎症反应。PLCε1通过增加炎症反应和血管形成促进鼠肠道肿瘤的发生。但是，PLCε1在结直肠癌发生过程中可能发挥抑癌基因的作用。另外，PLCε1在肿瘤的进展过程中也有极其重要的作用。PLCε1被Rho激活后，刺激了IP3的产生、细胞内Ca2+的流动、Ca2+/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）上调，导致细胞骨架蛋白细丝蛋白的磷酸化。细丝蛋白的磷酸化降低了其与细丝状肌动蛋白的相互作用，促进了头颈鳞癌细胞的迁移。RNA干扰技术沉默PLCε1基因抑制了膀胱癌细胞的侵袭能力。由此可见，PLCε1在肿瘤的发生和进展中均发挥重要的作用。
　　PLCε1在食管癌的发生、进展过程中发挥怎样的作用？研究表明，食管癌组织较正常食管粘膜PLCε1的阳性表达率高;哈萨克族ESCC病人食管癌组织中PLCε1的表达水平高于其癌旁正常组织，而且PLCε1的表达增加与较晚的临床分期和淋巴结转移相关。但是，PLCε1基因如何影响食管癌细胞的生物学行为及其可能的机制目前尚未见报道。
　　因此，本研究首先探讨PLCε1基因rs2274223 A/G SNP、rs11599672T/G SNP与中国北方高发区人群食管癌遗传易感性的关系，旨在寻找能够预测食管癌高风险个体的遗传标志物，以真正实现食管癌的早诊、早治，提高患者的生存率;为食管癌病因的遗传学研究提供依据。
　　本研究亦拟通过RNA干扰技术沉默食管癌Eca109细胞PLCε1基因，观察食管癌Eca109细胞生物学行为的变化，并测定增殖、凋亡、侵袭转移相关因子的表达水平，明确PLCε1影响Eca109细胞生物学行为的机制。研究将进一步确定PLCε1在食管癌进展中的作用及其机制，并为食管癌的基因治疗提供实验基础。
　　第一部分、PLCε1基因多态性与食管鳞状细胞癌遗传易感性的关联研究
　　目的:探讨PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP与河北省磁县高发区人群食管癌遗传易感性之间的关系。
　　方法:研究包括527例ESCC患者和527名健康对照个体。采集每位研究个体的静脉抗凝血5ml，于4℃冰箱保存。食管癌患者及健康对照个体的性别、年龄、吸烟习惯及上消化道肿瘤(upper gastrointestinalcancer，UGIC)家族史的情况均在采血后由专人询问获得。采血后1周内应用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA。采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction-ligasedetection reaction，PCR-LDR)方法对PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP进行基因分型，分析这两个SNP与磁县人群食管癌遗传易感性之间的关系。
　　结果:
　　1.ESCC患者组UGIC家族史阳性个体比例为48.6％，显著高于健康对照组(39.3％)（x2=9.25，P=0.002），表明UGIC家族史可显著增加ESCC的发病风险，经性别、年龄、吸烟状况校正后的OR值为1.47(95％CI=1.15～1.87)。
　　2.PLCε1基因rs2274223 A/G SNP基因型分布在健康对照组中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.21，P=0.65)。ESCC患者组及健康对照组的AA、AG、GG基因型频率分别为48.0％、43.9％、8.1％和57.1％、37.5％、5.4％。与AA基因型相比，携带AG、GG、AG/GG基因型可能增加ESCC的发病风险，经性别、年龄、吸烟状况、UGIC家族史校正后的OR值分别为1.41(95％CI=1.09～1.83)、1.71(95％CI=1.03～2.86)、1.45(95％CI=1.13～1.85)。与携带AA基因型的UGIC家族史阴性个体相比，携带AG/GG基因型的家族史阴性个体、携带AG/GG基因型的家族史阳性个体ESCC发病风险增加(OR=1.41和2.10，95％CI=1.02～1.97和1.46～3.01)。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP基因型分布在健康对照组中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.46，P=0.50)。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP等位基因频率和基因型频率总体分布在ESCC患者组及健康对照组之间无显著性差异(P＞0.05)。与携带TT基因型的UGIC家族史阴性个体相比，携带TT基因型的家族史阳性个体ESCC发病风险增加(OR=1.59，95％CI=1.13～2.24)。
　　4.应用2LD软件对PLCε1基因的rs2274223A/GSNP和rs11599672T/G SNP进行联合分析显示，两个多态性位点间不存在连锁不平衡现象(D'=0.11)。人群中最常见的单体型为AT，其在健康对照组中的频率为55.2％，其他单体型频率分别为AG(20.7％)、GT(17.5％)、GG(6.6％)。GT单体型增加了ESCC的发病风险(OR=1.36，95％CI=1.08～1.71)。
　　结论:
　　1.UGIC家族史可增加河北省磁县高发区人群ESCC的发病风险，遗传背景在食管癌的发生中发挥重要作用。
　　2.本研究首次报道了PLCε1基因rs2274223A/G SNP可以作为高发区人群ESCC遗传易感性的标志物。UGIC家族史阳性个体、携带PLCε1基因rs2274223 A/G SNP AG、GG基因型的个体、尤其是携带AG/GG基因型且UGIC家族史阳性个体罹患ESCC的风险较高，应定期接受食管内镜检查，以便真正实现ESCC的早期诊断、早期治疗。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP与河北省磁县高发区人群ESCC的发病风险无关。UGIC家族史与rs11599672T/G SNP联合分析表明，UGIC家族史增加TT基因型携带者ESCC的发病风险。
　　4.与最常见的AT单体型相比，GT单体型增加了ESCC的发病风险。
　　第二部分 shRNA干扰沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞增殖的影响及其机制的研究目的:探讨沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞增殖的影响及其可能的机制。
　　方法:根据shRNA设计原则，针对PLCε1基因不同靶点构建3个能够编码shRNA的质粒表达载体(PLCε11、PLCε12、PLCε13)，用于沉默PLCε1基因;同时构建1个通用阴性对照质粒表达载体(HK)作为对照。采用阳离子脂质体方法进行转染。首先以PLCε11为例摸索转染条件，确定转染效率，然后筛选出干扰效果最好的质粒表达载体(PLCε12)。RT-PCR和Western blot方法分别检测PLCε12质粒表达载体转染24h、48h、72h后Eca109细胞PLCε1基因mRNA和蛋白表达水平，确定PLCε12质粒表达载体RNA干扰的时间规律。MTT方法检测PLCε12质粒表达载体转染48h、72h、96h后Eca109细胞的存活率。FCM检测PLCε12质粒表达载体转染24h后Eca109细胞的细胞周期分布情况。RT-PCR方法检测Eca109细胞p16、CyclinD1的mRNA表达。分析沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞增殖的影响及其可能的机制。
　　结果:
　　1.质粒表达载体与阳离子脂质体按照2μg∶6μl比例进行转染时，转染效率最高，平均为72.6％。PLCε12质粒表达载体对PLCε1基因的干扰效果最好。PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后，PLCε1 mRNA表达水平于转染后24h开始下降，48h表达水平明显降低，72h恢复至转染前水平。PLCε1蛋白表达水平的变化与mRNA的表达变化规律一致。
　　2.MTT结果显示:HK、PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后48h、72h，PLCε12组Eca109细胞的存活率分别为80.73％和75.88％，显著低于HK组Eca109细胞的存活率，两者相比有统计学差异(P＜0.05);转染后96h，HK组与PLCε12组Eca109细胞的存活率无显著差异(P＞0.05)。
　　3.Eca109细胞转染后24h，Eca109组、HK组、PLCε12组处于S期的Eca109细胞分别占19.53％、17.20％和4.80％。Eca109组和HK组处于S期的Eca109细胞比例无统计学差异(P＞0.05);PLCε12组处于S期的Eca109细胞比例明显低于HK组(P＜0.05)，细胞周期阻滞于G0/G1期。
　　4.PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞48h后，HK组与PLCε12组Eca109细胞p16的相对光密度值分别为0.38和0.58，PLCε12组Eca109细胞p16 mRNA表达水平明显高于HK组Eca109细胞(P＜0.05);HK组与PLCε12组Eca109细胞CyclinD1 mRNA表达水平无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论:沉默PLCε1基因对Eca109细胞增殖具有抑制作用，细胞周期阻滞于G0/G1期。其可能的机制为:沉默PLCε1基因上调了p16基因的表达，p16蛋白抑制了CDK4的活性，抑制与CyclinD1结合的Rb的Ser和Tyr残基磷酸化，抑制转录因子E2F的释放，E2F依赖性基因转录表达受抑，阻止细胞从G1期向S期的过渡，因而抑制了Eca109细胞的增殖活性。
　　第三部分、shRNA干扰沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞凋亡、侵袭的影响及其机制的研究
　　目的:探讨沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞凋亡、侵袭的影响及其可能的机制。
　　方法:FCM检测PLCε12质粒表达载体转染48h后Eca109细胞的凋亡情况。Transwell小室侵袭实验检测PLCε12质粒表达载体转染48h后Eca109细胞的侵袭能力。RT-PCR方法检测Eca109细胞Fas、FasL、CD44、MMP9、VEGF的mRNA表达。分析沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞凋亡、侵袭的影响及其可能的机制。
　　结果:
　　1.Eca109细胞转染后48h，Eca109组、HK组和PLCε12组Eca109细胞的凋亡率分别为26.22％、22.06％和30.27％。Eca109组和HK组Eca109细胞的凋亡率无统计学差异(P＞0.05);但是PLCε12组Eca109细胞的凋亡率明显高于HK组Eca109细胞(P＜0.05)。
　　2.HK、PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后48h，HK组与PLCε12组Eca109细胞Fas的相对光密度值分别为0.43和0.53; FasL的相对光密度值分别为0.42和0.33。两组Eca109细胞Fas、FasL的mRNA表达水平存在统计学差异（P＜0.05）。
　　3.Eca109细胞转染后48h，Eca109组、HK组和PLCε12组穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的Eca109细胞数分别为85.00、82.00和62.67。Eca109组和HK组穿过Transwell小室膜的Eca109细胞数无统计学差异(P＞0.05); PLCε12组穿过Transwell小室膜的Eca109细胞数明显低于HK组(P＜0.05)。
　　4.HK、PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后48h，HK组与PLCε12组Eca109细胞MMP9的相对光密度值分别为0.60和0.53; VEGF的相对光密度值分别为0.28和0.17。两组Eca109细胞MMP9、VEGF的mRNA表达水平存在统计学差异（P＜0.05）。HK组与PLCε12组Eca109细胞CD44的mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1.PLCε1基因的沉默促进Eca109细胞的凋亡，可能是通过上调Fas的表达、下调FasL的表达，抑制了免疫逃逸和免疫反攻，使得Eca109细胞凋亡增加。
　　2.PLCε1基因的沉默抑制Eca109细胞的侵袭，其可能的机制为:通过降低MMP9、VEGF的表达，降低了Eca109细胞降解细胞外基质及促进新生血管形成的能力，因而抑制了Eca109细胞的侵袭能力。