ERCC1 3’UTR重叠基因CAST沉默及对顺铂所致人肺癌A549细胞DNA损伤修复的影响

前言
　　顺铂是目前应用最广泛的铂类抗肿瘤药物，主要用于治疗非小细胞肺癌、小细胞肺癌、睾丸癌（尤其是非精原细胞性）、卵巢癌。目前研究认为，顺铂的抗肿瘤作用主要在于其类似双功能基烷化剂，DNA是其作用的关键靶点。顺铂进入体内后在低氯环境中氯解离，形成水合阳离子，主要与DNA等生物大分子结合形成共价键。DNA上主要的结合位点是G和A的N7，由于顺铂与两个位点结合，故理论上可以形成链内交联、链间交联、DNA-蛋白质分子间交联，从而使DNA链局部扭结或解旋，阻止DNA聚合酶推进，致使DNA复制、转录失败，造成肿瘤细胞死亡。
　　核苷酸切除修复(NucleotideExcisionRepair,NER)是顺铂所启动的DNA损伤修复主要途径之一。在众多的DNA损伤修复途径和机制中，NER是DNA损伤修复系统中最重要而灵活的一种，对多种DNA双螺旋损伤变性，如顺铂、多环芳烃、紫外线C等环境致癌因子介导的DNA加合物，NER发挥主要的切除修复作用。ERCC1基因所编码的ERCC1蛋白是NER途径中的重要因子，ERCC1基因位于染色19q13.3，基因全长15×103bp，含10个外显子，编码含297个氨基酸的蛋白质，对生命至关重要。ERCC1其表达产物与着色性干皮病互补因子F(XPF)形成紧密的异源二聚体(ERCC1/XPF)，该二聚体是一个特异性的连结5'端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除庞大DNA加合物的双重作用，并且在NER中起到限速作用。
　　1989年VanDuin等人发现ERCC1非编码区域3'末端第10号外显子与另一基因重叠，存在一个开放阅读框架(OpenReadingframe)，从而该重叠基因被命名为CAST(CD3ε-associatedsignaltransducer,CD3EAP)，又称为ASE-1(即反义ERCC1，AntisenseofERCC1)或PAF49。CAST基因位于19q13.3，基因全长4558bp，含3个外显子，编码含512个氨基酸的蛋白质。这种罕见的人类基因重叠属于反向排列中的会聚型，在酵母、鼠等ERCC1同源体中高度保守，对其生物学意义所知甚少。Vogel等人发现ERCC1在参与DNA损伤修复及细胞存活的同时，CAST也参与细胞的增殖过程。
　　ERCC1在识别及修复由顺铂所致的加合物起关键的作用。尽管国内外相关人士已报道ERCC1mRNA水平及遗传多态性与顺铂的耐药有关，但是对ERCC1引起顺铂耐药进一步的机制研究所知甚少。而且，由于CAST位于ERCC13'非编码区的缘故，故推测可能影响ERCC1的表达。然而，国内外相关报道针对CAST及ERCC1这一重叠基因的关系研究仍是不太清楚，它们在生物体中是彼此促进还是相互抑制不得而知。
　　在本研究中首先通过收集肺癌术中肿瘤标本探讨ERCC1、CAST两基因表达之间及其与个体DNA损伤修复的关联;并采用RNN沉默和过表达技术，针对靶基因CAST进行沉默并且过表达ERCC1共同瞬时转染人肺腺癌A549细胞，并检测CAST基因沉默后对于内外源ERCC1mRNA水平及蛋白表达的影响;及给予顺铂处理后对DNA修复能力的变化。初步探讨CAST基因沉默后，对内外源ERCC1mRNA水平及蛋白表达的改变从而探讨DNA损伤修复能力是否受到影响？结合前期人群研究试图阐明CAST基因、ERCC1基因与细胞DNA损伤修复系统的关联，及挖掘CAST基因新的功能提供一些新的科学依据。
　　研究方法
　　1、肺癌组织的收集
　　从2013年10月至11月，收集来自沈阳市中国医科大学第一附属医院肺癌术中肿瘤标本15例。填写简单调查问卷:记录人口学特征、既往病史、家族史及生活方式（吸烟、饮酒）等一般状况。收集肺癌标本类型多为鳞癌和腺癌。告知研究对象并签署知情同意书后实施研究计划。一部分用于分析肺癌组织中CAST与ERCC1的关系;另一部分用于原代细胞培养。
　　2、细胞培养及处理
　　原代细胞及人肺腺癌细胞株A549用含10％FBS、10IU/ml青霉素、10IU/ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养。施加不同浓度顺铂对其细胞进行处理。
　　3、体外瞬时转染细胞模型的构建
　　3.1CAST-shRNA质粒及ERCC1-overexpression质粒均由上海吉凯公司设计合成。
　　3.2采用InvitrogenLipofectamine(R)2000转染试剂盒将CAST-shRNA及ERCC1-overexpression质粒及GFP空质粒分别同时转染A549细胞。
　　3.3转染细胞系的鉴定:Real-timePCR检测CAST基因mRNA水平;Westernblotting分别检测CAST及外源ERCC1基因蛋白表达。
　　4、CAST基因沉默对内外源性ERCC1表达的影响
　　采用Real-timePCR及Westernblotting分别检测CAST基因沉默对内外源ERCC1mRNA水平及蛋白表达。
　　5、瞬时转染细胞DNA损伤修复能力的检测
　　5.1细胞抑制率实验(MTT)测定顺铂处理后细胞存活率;
　　5.2彗星实验测定顺铂所致DNA的损伤情况;
　　结果
　　1、肺癌组织中CAST及ERCC1mRNA表达和顺铂耐药性检测
　　15例肺癌术中组织经Real-timePCR分析表明CAST与ERCC1表达呈正相关;原代细胞给予顺铂处理后，CAST与ERCC1基因分别与原代肺癌细胞的敏感性呈负相关，即表达量增加伴随顺铂敏感性下降。
　　2、体外瞬时转染细胞模型构建成功
　　2.1CAST-shRNA及ERCC1过表达质粒和GFP质粒分别同时转化感受态大肠杆菌(E.coliDH5α)，可选择分别生长于含氨苄和卡那霉素的LB琼脂平板。对提纯的质粒进行测序，CAST及ERCC1序列正确无误。
　　2.2CAST-shRNA及ERCC1-overexpression质粒及GFP空质粒分别同时转染A549细胞。各转染细胞可在24h后荧光显微镜下观察，可见表达绿色荧光蛋白的细胞，确定转染成功及转染效率。
　　2.3Real-timePCR筛选高沉默效率的CAST-shRNA，RNAi3为最佳质粒。
　　2.4Westernblotting分别检测CAST及内外源ERCC1基因蛋白表达，CAST及内源ERCC1分别可表达蛋白分子量为34KD和33KD，外源ERCC1表达蛋白分子量为58KD，证实瞬时细胞转染成功。
　　3、CAST基因沉默对内外源性ERCC1表达的影响
　　尽管过表达ERCC1，在CAST基因沉默的基础上，随着时间的延长，其内外源ERCC1的mRNA水平和蛋白表达与对照组相比均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、瞬时转染细胞DNA损伤修复能力的检测
　　4.1MTT实验结果显示在CAST沉默的基础上，随着顺铂染毒浓度的增加，转染细胞的细胞活性均呈下降趋势，并存在一定的剂量反应关系，表明各浓度顺铂对转染细胞的细胞活性均有抑制作用，且与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在CAST-shRNA与ERCC1-overexpression共同瞬时转染时，在顺铂处理24h后，各浓度的细胞存活率并无明显的差异，但是经过24h的恢复，8μg/ml和128μg/ml两个浓度的细胞活性均较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.2彗星实验结果显示CAST-shRNA与ERCC1-overexpression共同瞬时转染时，在顺铂处理24h和处理24h后继续培养24h两个时间点，除8μg/ml顺铂处理24h后继续培养24h外，其他各浓度相比较，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。随着顺铂浓度的增大，共转染细胞对表现出较强的敏感性，其产生的DNA链间交联越严重。
　　结论
　　1.位于DNA修复基因ERCC13'UTR的重叠基因CAST与ERCC1表达呈正相关;与顺铂所致肺癌细胞的敏感性呈负相关，即肺癌细胞CAST表达量增加伴随顺铂敏感性下降。
　　2.本研究发现CAST沉默后，ERCC1表达受到抑制，同时对顺铂所致的DNA损伤修复能力下降，CAST成为ERCC1基因表达及其发挥功能重要的共同因子，两者存在正向协同的关系。
　　3.顺铂所致Pt-DNA加合物启动细胞的核苷酸切除修复NER通路，而该通路核心因子ERCC1表达与肺癌细胞的耐药性密切相关，而CAST基因可能通过影响ERCC1的表达及功能参与NER，成为肺癌铂类个体化治疗的一个新靶点。