流式细胞术测定蠕形螨基因组大小

目的:蠕形螨感染可能与人类痤疮、毛囊炎、脂溢性皮炎、酒渣鼻、眼睑缘炎和外耳道瘙痒等病症有关，蠕形螨病致病机理的研究成为寄生虫学和皮肤病学领域倍受关注的课题。人群对蠕形螨普遍易感，国内报道人群感染率20％到90％不等，成年人患病率高达10％。目前有关蠕形螨的报道多见于形态学、流行病学、治疗药物等方面的研究。两种人体蠕形螨虫体微小，仅100μm～400μm，分别寄生于于毛囊、皮脂腺内。因取螨和清洗、分离、研磨粉碎等显微预处理技术瓶颈，限制了蠕形螨的分子生物学研究，目前这方面的研究成果鲜有报道。基因组是指单倍体细胞核内的全部DNA分子，或者是单拷贝染色体DNA的总量，其大小常用C值(C-value)来描述，单位为pg或Mb。测定一个物种的基因组大小对构建高质量基因文库有重要意义，也是研究一个物种基因组的重要参数，是筛选蠕形螨的功能基因和将来研究其分子致病机理的重要基础工作。本实验着力探索优化蠕形螨DNA的提取方法，采用流式细胞术(Flowcytometry，FCM)测定蠕形螨基因组大小，为进一步构建蠕形螨基因文库及其基因组学研究提供了理论数据，为下一步蠕形螨的分子生物学、分子遗传学、生物信息学研究做了基础铺垫。
　　方法:以山羊蠕形螨为实验材料，这是因为:人体蠕形螨实验样品需要志愿者提供;获取足量的实验螨有一定困难;人体蠕形螨样品的保存也有困难。山羊蠕形螨与人皮脂蠕形螨遗传相似度最近，样品容易获得，山羊蠕形螨导致羊皮病理损害已被公认，所以本实验以山羊蠕形螨为实验样本。样品从感染蠕形螨的波尔山羊皮肤结节中获取。自然沉降法清洗收集活螨。以组织匀浆器和超声波破碎螨体，在柠檬酸介质中分离蠕形螨的细胞核。家鸡血细胞经超声波细胞破碎仪处理后，同样采用柠檬酸介质分离细胞核。以PBS悬浮细胞核，稀释后经Giemsa染色，应用光学显微镜检查样品质量，包括细胞核密度及细胞碎片的检查。根据计数结果以PBS将细胞核悬液稀释至1.0×106个/ml，即适宜流式细胞仪检测的上机浓度。以动物基因组DNA抽提试剂盒提取蠕形螨核DNA，使用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，初步检测待检核DNA的纯度及大小。以家鸡血细胞核DNA含量为内标，混合家鸡血细胞核和蠕形螨细胞核，碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)染色后用流式细胞仪上机检测，记录610nm发射波长的PI荧光强度。运用WinMDI软件分析数据，比较蠕形螨与家鸡血细胞DNA含量峰值的倍数关系，计算出蠕形螨的基因组大小。
　　结果:采用柠檬酸介质分离得到完整、分散的细胞核，细胞碎片较少，稀释后样品浓度为1.0×106个/ml，满足流式细胞仪上机检测要求。用动物基因组DNA抽提试剂盒提取到蠕形螨蜡核DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，在20kb处获得一均匀亮带。采用FCM测得蠕形螨DNA含量约为1.05pg/2C，以1pgDNA相当于978Mb计算得出蠕形螨基因组大小约为512Mb。
　　结论:本研究成功分离了蠕形螨细胞核，运用动物基因组DNA抽提试剂盒快速高效提取到蠕形螨核DNA。普通琼脂糖凝胶电泳可进行基因组DNA完整性和纯度的初步分析，但不能将超过20kb大小的DNA分子分开。流式细胞术可快速、精确测定蠕形螨基因组大小。本研究获得了蠕形螨的基因组大小数据，丰富了蠕形螨的遗传学资料，为蠕形螨基因组研究奠定了基础。