肌肉特异性蛋白MG53在骨髓肌缺血缺氧损伤中的作用机制

目的
　　急性肢体缺血是血管外科最常见的疾病之一，其致残率和死亡率高，主要原因是由于手术中长时间的动脉夹闭、急性动脉血栓形成、动脉栓塞、创伤及血管损伤等，该病起病急剧，疼痛剧烈，且多在活动中突然发生，一旦肢体供血的主动脉突然中断，使远端肢体处于缺血缺氧状态，如持续发展会导致组织细胞功能失调甚至死亡。因此，早期明确诊断和治疗对于血管外科医生是一个极大的挑战。最近研究发现，肌肉特异性蛋白MG53在骨骼肌细胞膜的修复过程中起重要作用，并发现其对心肌细胞的急性缺氧、氧化应激及缺血再灌注损伤起到保护作用，但MG53在骨骼肌缺血缺氧损伤中的相关研究现尚未见报道。因此，本课题推测MG53能够在急性肢体缺血过程中对骨骼肌起到一定的保护作用。本研究主要探索MG53是否能够对急性肢体缺血过程中骨骼肌的损伤起到修复和保护作用以及相关作用机制。
　　实验材料与方法
　　1、实验动物及主要试剂
　　200～250g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠及2～3天新生雌雄不限SD大鼠购买于中国医科大学实验动物中心;CoC(l)2、MTT、二甲基亚砜购买于sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购买于HyClone公司;HIF-1α、MG53、BAX、Bcl-2、p27、GAPDH蛋白抗体购买于SantaCruz公司，流式细胞凋亡和增殖检测试剂盒购买于BD公司。
　　2、动物模型
　　200～250g雄性SD大鼠共30只，分为5组（每组6只），包括对照组(0h)6只，实验组根据不同的结扎时间分为4h、8h、12h和24h。所有大鼠经10％水合氯醛腹腔麻醉，实验组使用7-0血管线结扎左侧髂内、外动脉和股动脉，对照组仅暴露左侧髂内外动脉及股动脉而不结扎。不同时间点处死后切取肌肉标本，4％多聚甲醛固定或液氮中冻存。
　　3、苏木精和伊红染色
　　骨骼肌组织福尔马林固定，二甲苯酒精脱水，石蜡包埋切片。严格按照标准苏木精和伊红染色步骤，在普通光学显微镜(TE2000-S，Nikon,Japan)下观察结果。
　　4、透射电子显微镜观察
　　骨骼肌组织经2.5％戊二醛固定，四氧化锇固定及环氧树脂包埋，再经半薄切片，用1％甲苯胺蓝染色，在光镜下观察，并对合适的区域进行修整，超薄切片经乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在透射显微镜JEM-1200EX(Jeol，Tokyo，Japan)下观察结果。
　　5、乳酸脱氢酶及肌酸激酶检测
　　采集大鼠血样并收集在富含EDTA的离心管中，离心取上清置-70℃冷冻储存，所有样本均经全自动分析仪(Au2700，Olympus，Japan)检测。
　　6、细胞培养
　　大鼠骨骼肌来自于2～3天新生SD大鼠的四肢。贴壁法培养原代大鼠骨骼肌细胞，细胞被传代3～6次，置于37℃，5％CO2的培养箱中，应用含10％血清的高糖DMEM培养。
　　7、免疫荧光染色
　　骨骼肌细胞以104密度生长于24孔板或玻片上，PBS洗涤3次，用多聚甲醛固定，5％BSA室温封闭2小时，一抗4℃孵育过夜，荧光标记二抗室温孵育2小时，Hoechst33258染核。在倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微成像下观察染色情况(FV1000S-SIM/IX81,Olympus,Japan)。
　　8、免疫印迹
　　骨骼肌组织标本或细胞置于EP管中，加入适量蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂(PMSF)，匀浆机匀浆或超声破碎细胞，离心后提取蛋白，采用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，蛋白上样量为60μg，体积为20μl。配制10％聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、转膜、封闭（5％脱脂牛奶）、加入一抗4℃孵育过夜，洗膜45分钟，加入过氧化物酶标记的二抗，经37℃孵育2小时后ECL发光（MF-ChemiBis），并计算光密度值。试验重复3次。
　　9、慢病毒介导的shRNA的导入
　　采用MOI值为10∶1的病毒感染骨骼肌细胞，48小时后，在荧光显微镜(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下观察GFP荧光标记shRNA，明确感染效率。
　　10、细胞增殖检测
　　骨骼肌细胞接种于96孔板，生长至70％，经二氯化钴处理后依次加入MTT及DMSO，用ELISA96孔板机器(BIORAD680，USA)检测570nm处波长，数据显示为实验组细胞相对对照组细胞的百分比。
　　11、流式细胞术检测细胞凋亡
　　细胞经胰酶消化收集并PBS洗涤，按照BD公司AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡试剂盒说明操作，样本经流式细胞仪(FACSCaliber,USA)检测。
　　12、流式细胞术检测细胞周期
　　胰酶消化细胞，75％冰乙醇-20℃固定过夜，PBS洗涤一次，100ng/mlRNase及10ng/mlPI37℃染色1小时。流式细胞仪(FACSCaliber,USA)检测细胞周期，同时ModFitLT3.0软件分析细胞周期分布情况。
　　13、统计学分析
　　所有数据用均数±标准差表示。组内数据比较采用配对样本t检验。P＜0.05有统计学意义。
　　实验结果
　　1、急性缺血模型中骨骼肌和相关酶类的变化
　　急性缺血模型是通过结扎左侧髂内、外动脉及股动脉构成的。为了研究骨骼肌在急性缺血时组织形态学的变化，我们于不同缺血时间点进行HE染色。结果显示，在对照组中HE染色无任何明显变化，肌纤维排列规整，胞膜完整;实验组缺血4h、8h、12h和24h肌纤维受到损害，肌纤维宽窄不一，胞浆染色变浅，特别在缺血8h，而12h和24h未见明显加重。在透射电镜下也观察到相同的结果。此外，乳酸脱氢酶及肌酸激酶的检测也证明了以上的结论。在缺血4h和8h乳酸脱氢酶及肌酸激酶释放量升高最明显，在8h达到高峰。实验证明，在急性缺血过程中骨骼肌存在着特异性的变化趋势。
　　2、急性肢体缺血导致进行性骨骼肌损伤对MG53和HIF-1α表达的影响
　　为研究MG53和HIF-1α表达与骨骼肌完整性之间是否存在一定联系，通过实时定量PCR和免疫印迹来检测MG53和HIF-1α在急性肢体缺血模型中的表达情况。数据显示在急性缺血过程中，mRNA和蛋白水平上发现MG53和HIF-1α的表达呈进行性升高。实验结果显示，在急性缺血过程中，MG53和HIF-1α可能存在相似的变化趋势。
　　3、氯化钴诱导原代骨骼肌细胞急性缺氧模型中MG53和HIF-1α的表达趋势
　　采用特异性抗体横纹肌肌动蛋白鉴定原代培养的骨骼肌细胞。经过200uM氯化钴处理原代骨骼肌细胞分别于0h（对照组）、4h、8h、12h和24h检测MG53和HIF-1α的表达趋势。结果显示，与对照组相比，缺氧的骨骼肌细胞活力明显下降，同时也伴随着MG53和HIF-1αmRNA和蛋白水平上有相同升高的趋势，实验进一步证明两者之间可能存在的相关性。
　　4、二氯化钴诱导骨骼肌细胞凋亡和阻滞细胞周期进程
　　二氯化钴处理的骨骼肌细胞活力随时间的延长而下降。抗凋亡蛋白Bcl-2与骨骼肌细胞活力的趋势相似，而促凋亡蛋白BAX则随着时间的延长而上升，与骨骼肌细胞活力相反。流式细胞术检测骨骼肌细胞凋亡明显增加。实验证明二氯化钴能诱导骨骼肌细胞凋亡。同样，二氯化钴处理的骨骼肌细胞G0/G1期明显增多，S期明显减少。同样细胞周期抑制蛋白p27蛋白表达明显增加，因此我们认为二氯化钴能够阻滞骨骼细胞周期进程，促使细胞聚集在G0/G1期。
　　5、HIF-1α和MG53对骨骼肌细胞的影响
　　采用慢病毒载体携带HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分别将其表达抑制，结果显示:与对照组相比，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA细胞凋亡明显增加，抑制细胞周期进程;施加二氯化钴诱导骨骼肌细胞后，结果显示:与对照组相比，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA细胞凋亡和细胞周期抑制更加明显。说明HIF-1α和MG53的缺失能够引起骨骼肌细胞的损伤，在缺氧条件下能够加重损伤。再次说明两者对骨骼肌细胞具有相似的作用。
　　6、HIF-1α和MG53之间的关系
　　采用慢病毒载体携带HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分别将其表达抑制，转染后免疫印迹显示HIF-1α的沉默表达能够抑制HIF-1α和MG53的表达。相反，MG53的下调仅抑制其本身的表达。因此，推测MG53可能是由HIF-1α调控的一个新下游因子。
　　结论
　　1、急性下肢缺血过程中骨骼肌损伤存在特异性的变化趋势;
　　2、急性下肢缺血过程中HIF-1α和MG53表达进行性升高;
　　3、二氯化钴诱导骨骼肌细胞缺氧过程中HIF-1α和MG53表达进行性升高;
　　4、二氯化钴诱导骨骼肌细胞凋亡和阻滞细胞周期进程;
　　5、HIF-1α和MG53对骨骼肌细胞起到保护作用;
　　6、MG53可能是由HIF-1α调控的一个新下游靶基因。