一种增强基因表达的自激活GAL4/UAS系统表达盒的建立

基因导入系统较低的转染效率限制了基因转移技术的治疗效用，尽管病毒介导的载体系统可以具备相对较高的基因表达水平，但它在基因治疗中插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险;非病毒载体系统的免疫原性较低，安全可靠，并适于大规模生产，在外源基因短暂表达中具有优势，并广泛应用于各种DNA疫苗的研制，它的不足是体内转导效率低，靶向性差，基因表达时间短。综上，采用生物安全性较好的非病毒方式，如何增强外源基因表达，进而延长基因治疗的时间，受到人们越来越多的关注。
　　另一方面，重组蛋白表达技术是研究蛋白质结构、功能，及筛选靶向药物的有力工具，在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。截至目前，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核表达系统方便，便宜、周期短，但有些蛋白折叠不好，不带有糖基化等修饰;而哺乳动物表达系统——作为典型的真核表达系统，主要用于制备分泌的重组蛋白。相较于其他表达系统的宿主，它具有最出色的蛋白质折叠和二硫键形成能力，表达出的蛋白最接近天然蛋白，有利于蛋白结构和功能研究，但也存在着产量低，培养成本较高的劣势。因此，人们期望发明一种简单高效的瞬时表达系统，提高重组蛋白的生产效率。此外，在利用重组酿酒酵母呈递外源性DNA或RNA产生特异性抗体和杀伤性T细胞过程中，重组DNA疫苗引起特异性免疫反应可能较慢，产生特异性抗体的剂量较小。
　　Gal4/UAS系统是生物体中用于研究基因表达和功能的一种生物化学方法，本实验中在CMV表达载体的基础上增加一种自动激活的Gal4/UAS表达盒从而增强基因表达。首先，Gal4/UAS系统中2个上游激活序列(2UAS)，VP64，Gal4AD和VP64-p65-Rta三种DNA激活域进行比较，表达载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-Gal4BD-VP64的Luciferase表达量最高，大概是阴性对照组的16倍以上;然后将2UAS替换成4UAS，构建新的表达载体pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS，此表达载体激活的报告基因Luciferase的表达量是CMV启动表达载体的近23倍;接着在HEK293T细胞上研究了增强基因表达的稳定性，发现相比于阴性对照组，由表达载体pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS激活的报告基因Luciferase的表达水平从转染后第6～10天一直维持较高水平的表达，在转染后第8天达到了峰值。还在专门用于生产重组蛋白的CHO细胞系上进行了验证，增强效果依然十分显著(8倍以上)。综上，构建的Gal4/UAS系统表达盒可以自动催化或激活，在增强基因表达上产生显著效果;而且与以往报道的增强系统相比，结构简单、增强效果持久高效，该Gal4/UAS系统表达盒有望在提高重组蛋白的生产中成为一种强有力的工具，在非病毒基因介导途径中作为一种新的增强系统来提高目的基因的表达，在重组酵母呈递DNA疫苗的免疫和预防中发挥重要作用。