创伤后应激障碍大鼠齿状回VDR表达变化的研究

前言
　　创伤后应激障碍(post-traumaticstressdisorder，PTSD)是指个体由于经历对生命具有威胁的事件或严重的创伤，导致系列精神症状长期持续的精神障碍。报道显示遭受自然灾害、战争、暴力等人口的8-13％由于引发PTSD后而出现精神症状，且发生率在不断上升。PTSD症状一般在遭受创伤后数日甚至数月后出现。目前，PTSD的发病机制尚未阐明，神经元之间的突触效能的长时程增强可能是应激导致焦虑和条件性恐惧记忆的神经基础。
　　作为神经甾体激素，维生素D通过维生素D受体（vitaminDreceptor，VDR）介导调节神经递质，神经保护和神经免疫功能。VDR是核受体，在大脑皮质和海马中均有表达，VDR与神经退行性痴呆症相关联，也可能导致焦虑和运动障碍。本实验拟通过单程长时应激（singleprolongedstressparadigm，SPS）建立PTSD大鼠模型，观察大鼠齿状回VDR的表达变化情况，讨论VDR在PTSD发病机制中的作用，力争为PTSD防治新靶点提供实验依据。
　　材料和方法
　　一、PTSD大鼠模型制备与实验分组
　　雄性SD大鼠(200-250g)，禁锢2小时后，立即强迫游泳20min（水深40cm，水温25℃）。经过15min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失。
　　将PTSD模型大鼠随机分为4组:SPS1d、SPS3d、SPS7d、SPS14d组，正常饲养大鼠作为对照组。
　　二、行为学检测
　　SPS7d组大鼠与对照组大鼠进行旷场试验和高架十字迷宫试验，评估SPS对大鼠焦虑行为的影响。
　　三、取材
　　将各组大鼠麻醉，生理盐水或4％多聚甲醛灌注，断头取脑，6只大鼠大脑用4％多聚甲醛浸泡固定备用（免疫组织化学），另六只大脑取齿状回，-70℃冻存备用(WesternBlot和RT-PCR)。
　　四、免疫组织化学
　　4％多聚甲醛固定组织24小时，30％蔗糖溶液沉糖12小时后切片，切片厚度约7μm;根据S-P试剂盒说明书操作，进行VDR免疫组织化学染色，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片后晾干，室温保存。
　　五、WesternBlot
　　大鼠齿状回组织，剪碎裂解过夜，4℃离心(12000r/min，30min)，取上清。进行蛋白定量后，电泳、转膜、封闭，一抗(兔抗鼠多克隆抗体VDR，1∶500)4℃过夜，二抗（HRP标记羊抗兔IgG，1∶5000）37℃孵育1h，ECL化学发光法显色，凝胶成像图像分析系统分析。对照选用抗GAPDH抗体。目的蛋白与相应GAPDH蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。
　　六、RT-PCR
　　大鼠齿状回组织，提取总RNA，反转录合成cDNA，扩增完成后进行RT-PCR。
　　七、统计学处理
　　采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数±标准差（(x)±S）表示。各组VDR的比较采用单因素方差分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　实验结果
　　一、行为学检测结果
　　旷场试验结果显示:与对照组相比，SPS7d组大鼠在中心停留的时间、在中心区域运动的距离均显著减少。
　　高架十字迷宫试验结果显示:与对照组相比，SPS7d组在开放臂停留时间及进入开放臂次数显著减少。
　　二、免疫组织化学
　　免疫组织化学染色结果显示，SPS大鼠齿状回VDR蛋白表达出现一过性升高，在SPS7d组VDR蛋白表达达到最高。
　　三、WesternBlot
　　WesternBlot结果显示:SPS大鼠齿状回VDR蛋白表达出现一过性升高，在SPS7d组VDR蛋白表达达到最高，与免疫组化结果一致。
　　四、RT-PCR
　　RT-PCR结果显示:SPS大鼠齿状回VDRmRNA表达出现一过性升高，在SPS7d组VDRmRNA表达达到最高，与免疫组化及WesternBlot结果一致。
　　结论
　　PTSD大鼠齿状回VDR表达呈一过性增高，SPS后第七天达到峰值，之后逐渐下降。
　　PTSD大鼠行为学改变可能与齿状回VDR表达变化相关。