巴戟胶囊浸膏药效成分含量测定和对骨质疏松大鼠的疗效及机制研究

背景：
　　巴戟胶囊浸膏是上市中成药（国药准字Z20050069），是由巴戟天、何首乌、淫羊藿、续断等16味中药材组成的复方制剂。功能:补肾壮腰，调经。主治:用于肾阳不足而致的神疲不振，腰膝软弱，亦用于夜尿频繁，月经不调。但该上市中成药缺乏药效成分含量的控制标准，临床应用中发现该制剂具有一定的改善更年期绝经后妇女骨质疏松的作用。本实验室受生产厂家重庆希尔安药业有限公司委托，进行巴戟胶囊质量控制标准提升，以及巴戟胶囊改善更年期妇女骨质疏松的效果验证，并研究其可能的作用机制。
　　目的：
　　1.建立巴戟胶囊浸膏药效成分含量测定方法，为制订其质量控制标准奠定基础，阐释临床疗效的物质基础。
　　2.观察巴戟胶囊浸膏对雌性去势骨质疏松模型大鼠的治疗效果，并初步探讨其作用机制，为临床扩大适应范围提供实验依据。
　　方法：
　　1.巴戟胶囊浸膏主要药效成分的含量测定
　　参照《中国药典》一部(2010年版)，采用紫外分光光度法和高效液相色谱法对巴戟胶囊浸膏中与抗骨质疏松有关的主要药效物质总多糖、总蒽醌、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ、阿魏酸、绿原酸、梓醇等成分进行检测，建立该制剂10种药效物质含量测定方法，为其复方质量标准的初步建立和药效学研究结果的进一步验证提供实验依据。
　　2.巴戟胶囊浸膏对雌性去势骨质疏松模型大鼠的药效学实验研究
　　(1)巴戟胶囊浸膏对雌性去势大鼠骨质疏松模型血清生化指标的影响实验
　　取70只SD大鼠，雌性，体重230±10.0 g。随机分为7组，分别为模型对照组、中药（仙灵骨葆）阳性对照组(0.27 g·kg-1·d-1)、西药（阿仑膦酸钠）阳性对照组(0.003 g·kg1·d-1)、假手术对照组、巴戟胶囊浸膏低剂量组(0.09 g·kg-1·d-1)、巴戟胶囊浸膏中剂量组（0.27 g·kg1·d-1）、巴戟胶囊浸膏高剂量组(0.81 g·kg-1·d-1)，每组10只。除假手术对照组外，所有大鼠均手术摘除卵巢建立骨质疏松动物模型，以阴道涂片和全身骨密度扫描判定造模是否成功。取造模成功的动物60只，术后1月开始给药，每天1次，连续灌胃3个月。假手术组和模型组给予同等量的溶媒。所有大鼠在给药结束时收集24 h空腹尿液，称重后股动脉放血处死。取血清，检测钙(Ca)、磷(P)、1，25双羟维生素D3(1，25(OH)2VD3)、碱性磷酸酶（AKP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量。取血浆，检测骨钙素(OC)、甲状旁腺素(PTH)及成骨生长肽(OGP)的含量。取24 h上清尿液，检测尿胶原吡啶交联产物(PYD)的含量。
　　(2)巴戟胶囊浸膏对雌性去势大鼠骨质疏松模型骨矿含量的影响实验
　　动物分组及手术造模方法同上。大鼠处死后，取左侧股骨置于烤箱中60℃过夜，电子天平称其干重(g)，马氏炉中800℃锻烧6h，再称其灰重(g)。计算每克骨组织的灰分含量。取骨灰溶于混酸（浓硝酸∶高氯酸=4∶1）消化后，用TAS-990型原子吸收分光光度计测定骨铜、锌、铁、钙及镁的含量。
　　(3)巴戟胶囊浸膏对雌性去势大鼠骨质疏松模型骨密度的影响实验
　　动物分组及手术造模方法同上。大鼠处死后，取右侧股骨和腰椎(L1-4)，剔除软组织，用骨矿物质含量分析仪（美国GE公司生产的DPX型双能X线骨密度仪）测定大鼠右侧股骨和腰椎骨密度(BMD)。
　　(4)巴戟胶囊浸膏对雌性去势大鼠骨质疏松模型骨形态计量学的影响实验
　　动物分组及手术造模方法同上。大鼠处死后，取大鼠左侧胫骨和腰椎(L5)制作骨组织石蜡切片，HE染色，采用OLYMPUSDP72显微镜采集图像，Image-proplus6.0图像分析系统对骨组织形态计量学松质骨和皮质骨静态参数进行测量和计算。
　　(5)巴戟胶囊浸膏对雌性去势大鼠骨质疏松模型骨生物力学的影响实验
　　动物分组及手术造模方法同上。大鼠处死后，取股骨、腰椎试验。①股骨三点弯曲实验:取大鼠右侧股骨全长，剔除周围软组织后置于万能材料试验机上，支点跨距20mm，加压点为中点，选取标定载荷10 kg，加载速度2mm· min-1，记录其载荷-位移曲线和应力-应变曲线。②腰椎压缩实验:完整取出腰椎(L1-4)，剔除周围软组织，剪除椎体上下椎间盘、棘突及附件，并用细砂纸打磨成上下平面平行且与纵轴垂直高度约为6.0 mm的圆柱体后进行椎体压缩试验，取加载速度5.0 mm· min-1，记录其载荷-位移曲线与应力-应变曲线。
　　3.巴戟胶囊浸膏对雌性去势骨质疏松模型大鼠的作用机制研究
　　采用免疫组织化学方法检测骨保护素(0 steoprotegerin，OPG)和核因子κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL）的蛋白表达，初步探讨巴戟胶囊复方浸膏治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。
　　结果：
　　1.巴戟胶囊浸膏主要药效成分的含量测定
　　参照《中国药典》一部(2010年版)采用高效液相色谱法和紫外分光光度法对巴戟胶囊浸膏中主要药效成分的含量进行测定，测得巴戟胶囊浸膏中总多糖含量为188.99 mg·g-1，总蒽醌含量为1.6189 mg·g-1，二苯乙烯苷含量为33.85 mg·g-1，游离大黄素含量为80.45μg·g-1，游离大黄素甲醚含量为41.17μg·g-1，淫羊藿苷含量为3.228 mg·g-1，川续断皂苷Ⅵ含量为5.0391 mg·g-1，阿魏酸含量为0.5466 mg·g-1，绿原酸含量为0.9501 mg·g-1，梓醇含量为0.3426 mg·g-1。
　　2.巴戟胶囊浸膏对雌性去势骨质疏松模型大鼠的药效学实验研究
　　(1)巴戟胶囊浸膏能显著性升高雌性去势大鼠血清OC并降低AKP和TRAP水平，促进骨形成，抑制骨吸收，降低骨转换
　　与假手术组比较，模型组血清1，25(OH)2VD3和OGP水平显著性降低（P＜0.05），血清OC水平极显著性降低(P＜0.01)，血清PTH显著升高(P＜0.05)，血清TRAP、AKP和尿液PYD水平极显著性升高(P＜0.01)，显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组均能显著提高雌性去势大鼠血清OC水平（P＜0.05），0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1剂量组能显著降低血清AKP和TRAP水平（P＜0.05），0.09 g·kg-1剂量组有降低血清AKP和TRAP水平的趋势，但无显著性差异(P＞0.05);0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组有升高血清1，25(OH)2VD3、OGP和Ca、P水平，降低血清PTH水平和尿液PYD水平的趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。
　　(2)巴戟胶囊浸膏能显著性增加骨灰重和骨锌含量，改善骨矿化和微量元素平衡
　　与假手术组比较，模型组股骨长度、直径、干重和骨铁含量显著性减小（P＜0.05），股骨湿重、灰重和骨铜、锌、钙、镁含量极显著性减少（P＜0.01），显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组均有增加股骨长度和直径、椎骨直径，增加股骨湿重、干重、灰分含量的趋势，但无显著性差异(P＞0.05);0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1剂量组均能明显增加股骨灰重（P＜0.05），0.09 g·kg-1剂量组有增加股骨灰重的趋势，但无显著性差异(P＞0.05);0.81g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组均能明显增加骨锌含量（P＜0.05），有增加骨铁、铜、钙、镁含量的趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。
　　(3)巴戟胶囊浸膏能显著性提高雌性去势大鼠股骨和椎骨骨密度
　　与假手术组比较，模型组股骨和椎骨密度均极显著性减小（P＜0.01），显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组极显著性增加椎骨密度（P＜0.01），0.81 g·kg-1剂量组极显著性增加股骨密度(P＜0.01)。
　　(4)巴戟胶囊浸膏能显著性增加胫骨皮质骨面积百分率并减小骨髓腔面积百分率，防止皮质骨量丢失
　　与假手术组比较，模型组大鼠腰椎(L5)松质骨骨小梁面积百分数（％Tb.Ar）、骨小粱数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、胫骨皮质骨面积百分率（％Ct.Ar）极显著性减少(P＜0.01)、皮质骨面积(Ct.Ar)显著性减小(P＜0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨髓腔面积百分率（％Ma.Ar）极显著性增加(P＜0.01)，显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组均能极显著性地增加大鼠胫骨皮质骨面积百分率（％Ct.Ar）和减小骨髓腔面积百分数(％Ma.Ar)（P＜0.01）;各剂量组有增加椎骨松质骨骨小梁面积百分数（％Tb.Ar）、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、胫骨皮质骨面积(Ct.Ar)和减小椎骨骨小梁分离度(Tb.Sp)的趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。
　　(5)巴戟胶囊浸膏能显著性增加股骨和椎骨最大负荷，提高其抗弯曲和抗压缩能力
　　与假手术组比较，模型组股骨最大负荷和最大位移、椎骨最大负荷、最大位移和模数均极显著性减小(P＜0.01)，显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1剂量组能显著性增加股骨最大负荷(P＜0.05)，0.81 g·kg-1、0.27g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组能显著性增加椎骨最大负荷(P＜0.05)，提示有增强股骨抗弯曲能力和椎骨抗压缩能力的效果;0.09 g·kg-1剂量组有增加股骨最大负荷的趋势，0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组有增加股骨和椎骨最大位移、模数的趋势，但均无显著性差异(P＞0.05)。
　　3.巴戟胶囊浸膏能显著性上调雌性去势大鼠椎骨OPG并下调RANKL蛋白表达
　　与假手术组比较，模型组大鼠椎骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达阳性密度极显著降低（P＜0.01），RANKL蛋白表达阳性密度极显著增高(P＜0.01)，显示造模成功。与模型组比较，巴戟胶囊浸膏0.81 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.09 g·kg-1剂量组极显著增高雌性去势大鼠椎骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达，极显著降低成骨细胞和骨髓基质细胞RANKL蛋白表达(P＜0.01)。
　　结论：
　　1.巴戟胶囊浸膏中总多糖含量为188.99 mg·g-1，总蒽醌含量为1.62 mg·g-1，二苯乙烯苷含量为33.85 mg·g-1，游离大黄素含量为80.45μg·g-1，游离大黄素甲醚含量为41.17μg·g-1，淫羊藿苷含量为3.23 mg·g-1，川续断皂苷Ⅵ含量为5.04 mg·g-1，阿魏酸含量为0.55 mg·g-1，绿原酸含量为0.95 mg·g-1，梓醇含量为0.34 mg·g-1。可作为巴戟胶囊浸膏初步质量控制标准。
　　2.巴戟胶囊浸膏在一定程度上能改善雌性去势骨质疏松模型大鼠的骨物理学、生物力学和形态学性质，并通过调节骨代谢、增加骨密度和骨矿含量等途径发挥对骨质疏松症的治疗作用。
　　3.巴戟胶囊浸膏能够上调雌性去势骨质疏松模型大鼠骨组织中OPG并下调RANKL的蛋白表达水平，调节OPG/RANKL系统，可能是其改善绝经后骨质疏松症的重要作用机理之一。