肝素寡糖与血管活性肠肽抗菌活性结构域相互作用的初步研究

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是由28个氨基酸组成的直链阳离子神经肽，在体内广泛分布并发挥多种重要的生物作用。VIP作为神经递质、神经调节剂和神经营养因子对中枢神经系统发挥重要的保护作用，这种作用与VIP强大的抗炎、抗氧化及抗凋亡功能有关。已经证实，VIP与多种神经发育性和神经炎症疾病如唐氏综合症、胎儿酒精综合症、多发性硬化、帕金森病和阿尔兹海默病等有关。研究发现，肝素与VIP的相互作用可能在VIP的神经保护机制中扮演重要角色，VIP可促进脑肥大细胞分泌多种神经保护性物质如神经生长因子和肝素等，肥大细胞分泌的肝素可以使VIP与其受体失偶联，增加细胞内的c-AMP浓度而介导VIP的细胞内作用。本研究以VIP体外抗菌活性为指标，初步探索了肝素寡糖与VIP的相互作用，并构建了表达VIP的大肠杆菌菌株，表达纯化出纯度超过95％的VIP及15N-VIP，为研究肝素寡糖对VIP结构的影响奠定了基础。
　　1.内含肽介导的VIP及15N-VIP表达纯化
　　采用内含肽介导的几丁质标签亲和纯化(IMPACT)系统来制备VIP及15N标记的VIP(15N-VIP)。其策略是将目的蛋白和内含肽(intein)及几丁质结合域(CBD)融合表达，由CBD介导使融合蛋白和几丁质树脂亲和结合，由具有可诱导自剪切活性的蛋白剪接元件—intein介导，使目的蛋白与亲和标签分离。本实验选用的表达载体为pTWIN1，将插入片段连接在载体的SapⅠ和PstⅠ酶切位点间，构建表达融合蛋白CBD-SspDnabIntein-VIP的重组载体pTWIN1-VIP，通过温度和缓冲液pH的改变诱导intein的自切割活性。
　　首先根据大肠杆菌的密码子偏好性设计编码VIP28个氨基酸的cDNA序列，并在其3'和5'端分别加入SapⅠ酶切位点和终止密码子、PstⅠ酶切位点。将所设计的序列插入PUC57载体，人工合成重组载体PUC57-VIP。以重组载体PUC57-VIP为模板进行PCR扩增目的基因，然后用限制性内切酶SapⅠ和PstⅠ切割PCR产物作为待插入片段。以相同的限制性内切酶酶切表达载体pTWIN1，再用T4DNA连接酶将插入片段和线性载体连接，测序结果表明成功构建重组载体pTWIN1-VIP。将重组载体转化入表达菌ER2566，成功构建表达融合蛋白CBD-SspDnabIntein-VIP的工程菌。
　　与未诱导组相比，工程菌表达大小约30kD的蛋白，进一步说明重组载体构建正确。
　　IPTG浓度的影响:首先考察了IPTG浓度对融合蛋白表达量的影响，发现IPTG浓度对表达量的影响很小，0.3mM时表达量稍有提高。
　　诱导温度的影响:诱导温度对融合蛋白的表达量及结构形成至关重要。本实验考察了15℃、25℃和30℃诱导时融合蛋白的表达量及被诱导切割的效率。电泳结果发现，诱导温度越低，上清可溶性表达的融合蛋白比例越大，且15℃和25℃诱导时融合蛋白没有发生胞内切割;30℃诱导时，上清可溶性表达的融合蛋白比例降低，且约有77％被胞内切割。诱导温度为15℃和25℃时融合蛋白不能被切割，而诱导温度为30℃时，融合蛋白的在柱切割效率约为68％。故最终确定的诱导表达条件为0.3mMIPTG、30℃诱导3h。
　　切割缓冲液pH值的影响:考察了pH为5.0至7.0的切割缓冲液对融合蛋白切割效率的影响，结果表明，pH6.0时切割效率最高。
　　使用微型透析柱对目的肽洗脱液进行脱盐，再用MWCO分别为10kD和2kD的超滤管超滤脱盐后的样品，进一步除去大小约为30kD和小于2kD的杂质。最终可从1L发酵液中获得270.8μg纯度大于95％的VIP，LC-IT-TOF质谱检测的VIP分子量(3323.82Da)与理论值一致。
　　用构建的表达CBD-，spDnabIntein-VIP的大肠杆菌菌株在15N-M9培养基中表达15N标记的融合蛋白。诱导温度为15℃、25℃和30℃时发现，融合蛋白都发生了不同程度的胞内切割，且30℃时融合蛋白的比例相对最高，在柱切割效率约为56％。对目的肽洗脱液脱盐及超滤后，可从1L发酵液中获得100.5μg纯度大于95％的15N-VIP。LC-IT-TOF质谱检测纯化的15N-VIP分子量(3366.76Da)与理论值一致。
　　2.肝素寡糖的制备及分离纯化
　　使用肝素酶Ⅰ在优化的条件下对肝素钠进行酶解。100mg肝素钠溶解后加入40μL肝素酶Ⅰ溶液，35℃水浴反应6h。使用BiogelP10凝胶层析柱，以0.2MNH4HCO3溶液为流动相，以0.16mL/min的流速对各肝素寡糖组分进行分离。使用PDMidiTrapG-10柱对分离的各肝素寡糖进行脱盐。负离子电子轰击质谱(ESI-MS)结果表明，所分离纯化的各肝素寡糖分子量与理论值相符。
　　3.肝素寡糖抑制VIP抗菌活性的研究
　　径向扩散法(radical diffusion assay，RDA)是检测分子抗菌活性的灵敏有效的方法。本实验选择C.albicans作为受试菌，用RDA法检测肝素寡糖对VIP抗菌活性的影响。本实验考察了等摩尔的各肝素寡糖对C.albicans的作用，与VIP(500μg/mL)等摩尔的各肝素寡糖对其抗菌活性的影响及不同摩尔数的肝素八糖对VIP(500μg/mL)抗菌活性的影响。实验结果表明，RDA法可灵敏地检测VIP的抗菌活性及抗菌活性的变化。对抑菌圈直径进行统计分析后表明:(1)各肝素寡糖对C.albicans无抗菌作用;(2)除dp2和dp4外，其他各肝素寡糖可明显抑制VIP的抗菌活性，且dp8的作用最明显;(3)随着dp8与VIP摩尔比的降低，dp8对VIP抗菌活性的抑制作用减弱，在dp8与VIP的摩尔比降到约1∶6时达到平台期，无可见的抑制作用。
　　综上所述，本论文确证了肝素寡糖可以与VIP相互作用，且作用区域为VIP的抗菌活性结构域，肝素八糖为最短的有效结合片段。成功构建了VIP在大肠杆菌中的重组表达体系。肝素与VIP的相互作用在VIP的神经保护机制中扮演重要角色。本课题对深入研究肝素寡糖与VIP在分子水平上的相互作用，进而探索VIP发挥神经保护作用的内在机制提供了良好的前期基础。