microRNA-200a抑制TGF-β1诱导肝星状细胞增殖作用的机制研究

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)通常是由体内外多种刺激因素,如酒精、肝毒物、酶催化剂及过敏原性物质等共同作用于肝脏所引起的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积的病变过程。肝星状细胞(hepatic stellates cell,HSC)的活化作为肝纤维化形成和发展的中心环节,可受到多条信号通路及细胞因子的影响,如 Wnt/β-catenin通路、转化生长因子β1(TGF-β1)介导的TGF-β/Smad通路等。此外,除了受到传统信号通路的影响外,近年来发现,HSC的活化还可受到microRNA(miRNA)的调控。miRNA作为继转录因子外,参与基因转录调控的另一类新兴因子,在细胞的发育、分化、代谢及细胞信号通路转导等一系列生命活动中均产生了重要作用。其中,miR-200a在癌症及纤维化疾病中逐渐显示出的多重效应引起了研究人员的普遍关注。但miR-200a是否以及如何参与 TGFβ和Wnt/β-catenin通路在 HSC的活化则鲜有报道。本课题通过研究miR-200a在大鼠病理性肝纤维化组织及活化的HSC中的表达变化,在分子水平上,深刻探讨其对TGFβ和Wnt/β-catenin通路的影响,以揭示miR-200a介导HSC活化的新的作用机制。
　　本研究按照正常组10只、CCl4模型组15只的标准将雄性Sprague Dawley大鼠分为两组。自实验开始后,模型组大鼠给予1ml/kg50％CCl4植物油溶液皮下注射建立肝纤维化模型,每周2次,总计12周;正常组给予同剂量油溶液皮下注射。12周造模结束后,取肝组织进行H&E及Masson胶原染色检测,并采用免疫组化法测出α-SMA在大鼠肝组织中的表达变化。通过实时定量PCR检测CCl4模型组大鼠肝纤维化组织及在不同浓度、时间点TGF-β1刺激的HSC中miR-200a的表达。通过脂质体LipofectamineTM2000转染miR-200a mimics(模拟物)至肝星状细胞内以观察miR-200a对TGF-β1诱导的HSC活化的影响,采用荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率。对于体外培养的大鼠 HSC,转染不同浓度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM),4-6 h后用5ng/ml TGF-β1刺激细胞24 h或48 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,流式细胞术观察 miR-200a对 TGF-β1诱导的HSC的增殖、周期、凋亡的影响。运用生物数据库预测出miR-200a的潜在性功能靶点:转化生长因子β2(TGF-β2)和β-链蛋白(β-catenin)。利用双荧光素酶报告基因技术验证这一预测并采用PCR及Western blots等技术,分别检测TGF-β1诱导活化的HSC中α-SMA,TGF-β2,β-catenin mRNA及蛋白水平的表达。
　　结果：发现,在体内实验中,与正常组相比,miR-200a在CCl4诱导的肝纤维化组织中,其表达是降低的。在体外实验中,用不同浓度(0,5,10,15 ng/ml)的TGF-β1,以及在不同时间点(0,6,24,48 h)用同一浓度的TGF-β1(5ng/ml)分别刺激 HSC,miR-200a的表达呈现出剂量-时间依赖性下调趋势。与阴性对照组相比,不同浓度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM)瞬时转染进入HSC,可以显著降低TGF-β1诱导的α-SMA的表达水平。过表达miR-200a可以明显抑制TGF-β1刺激的HSC的增殖及活化,但并未增加细胞的凋亡。此外,采用双荧光素酶报告系统证实了TGF-β2和β-catenin是miR-200a的功能性靶点。在TGF-β1刺激活化的HSC中,miR-200a可以显著降低TGF-β2的mRNA及蛋白水平表达,但对于其另一个靶点β-catenin,miR-200a只能降低其蛋白水平表达,对其mRNA水平则不产生影响。以上研究提示,miR-200a对TGF-β2及β-catenin二者的作用方式存在差异,miR-200a可通过影响不同靶蛋白(TGF-β2,β-catenin)的表达,参与调控TGF-β及Wnt/β-catenin通路,为探索肝纤维化中细胞的增殖和活化提供了新的研究思路。