大肠杆菌工程菌发酵乳糖制备D-塔格糖的研究

D-塔格糖属于稀有糖中一种，为D-半乳糖的同分异构体，是自然界中少量存在的天然己酮糖。D-塔格糖口感与蔗糖相似，甜度是蔗糖的92％，但其能量仅为蔗糖的30％左右，是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型低热量甜味剂。
　　D-塔格糖主要由D-半乳糖经生物转化法或化学合成法异构生成，生物转化法又包括体外酶转化法与全细胞催化法。目前，对于体外酶转化法以及化学合成法的研究较为广泛，对全细胞催化法的研究比较少。但是酶法及化学法工艺复杂，步骤繁琐，且主要以D-半乳糖作为生产D-塔格糖的主要原料，生产成本较高，不利于工业化生产。
　　本文利用代谢工程和基因工程技术构建大肠杆菌工程菌-E.coliBL21(DE3)lacZ+galK-/pET15b(araA)，直接利用廉价乳糖为生产原料，全细胞发酵一步生成D-塔格糖，具有工艺简单，原料来源广泛，生产成本低等优点，可大规模工业化生产。
　　对工程菌E.coliBL21(DE3)lacZ+galK-/pET15b(araA)全细胞发酵乳糖制备D-塔格糖发酵工艺进行了优化研究，并对D-塔格糖的分离提取进行了初步研究。
　　为获得较高的菌体生物量及塔格糖产量，首先，本文对发酵培养基及培养条件进行了一系列优化，得到最佳发酵条件:LB乳糖为基本培养基，乳糖浓度为7g/L，添加2.5mMFeSO4/MgSO4，发酵温度37℃，发酵pH8.0，转速200rpm。然后对其在最适发酵条件下的发酵动力学进行研究，结果显示其发酵过程可分为两个阶段:第一阶段，重组菌开始生长同时水解乳糖，9h后TaMAI(L-AIfromThermoanaerobactermathranii)开始表达，至30h时菌体生长及TaMAI表达稳定;第二阶段，菌体生长量与TaMAI表达量不再增加，TaMAI继续催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖。最后，本文根据发酵动力学结果，对TaMAI催化反应阶段的温度、pH及硼酸盐的添加量等条件进行了优化，得到最适催化反应条件为温度60℃、pH8.5、N四硼酸钠∶N乳糖为0.5，最终使D-塔格糖转化率达到60％。
　　文章第二部分主要对发酵液中D-塔格糖进行初步提纯。首先采用高速离心去除菌体细胞、活性炭吸附色素、硼特效树脂IRA-743脱除硼酸盐等工艺对发酵液进行了预处理，然后通过酿酒酵母选择代谢D-半乳糖，醇析与透析结合法除蛋白，阴阳离子交换树脂除盐等工艺进一步纯化，最后可回收约64.8％的D-塔格糖。