人肝细胞色素b5对10种细胞色素P450亚型活性的影响

细胞色素b5(cytochrome b5，Cyt b5)是内质网膜上含血红素的小分子蛋白，在胆汁酸去饱和、高铁血红素蛋白还原、类固醇生成及药物代谢过程中通过向多种酶传递电子发挥作用。细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)在人体内主要分布于肝脏，参与75％以上药物代谢，主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等10种亚型。CYP活性的不同是临床药物个体差异的主要原因，最新的研究表明，Cyt b5能为CYP的催化反应提供电子，增强CYP的催化反应效率。Cyt b5在大样本正常人肝中的表达水平目前尚无报道，Cyt b5在人肝微粒体（Human liver microsomes，HLM）水平对CYP活性个体差异的影响也很少有人报道。
　　用人肝微粒体作为研究对象更能准确反应自然状态下Cyt b5对CYP代谢的影响，但是目前很少有关于人肝微粒体中Cyt b5对CYP催化反应影响的研究。故此我们首次系统研究了在正常人肝微粒体中Cyt b5含量对CYP催化反应的影响。本研究采用大样本正常人肝作为实验对象，首先用qPCR的方法测定107例人肝中Cyt b5 mRNA表达水平，然后用光谱法考察测定123例人肝微粒体中Cyt b5的蛋白含量，分析Cyt b5含量对10种CYP亚型酶动力学参数的影响，探讨CYP活性个体差异的原因。
　　1方法：
　　1.1肝脏标本的收集收集肝功能正常的肝病患者肝标本123例，标本来自郑州大学第一附属医院、河南省人民医院及河南省肿瘤医院。其中男性40例，女性83例，年龄在20-75岁，用药史显示近期未使用能够显著影响CYP酶活性的药物。此次实验方案经郑州大学医学伦理委员会批准，受试者已签署知情同意书。
　　1.2人肝微粒体的制备使用差速离心法制备人肝微粒体。
　　1.3 Cyt b5蛋白含量测定使用光谱法测定Cyt b5蛋白含量。
　　1.4 Cyt b5 mRNA含量的测定用Trizol法提取肝组织总RNA，然后将1μg的总RNA逆转录成 cDNA，两步法在7500 Fast Real-Time PCR System进行PCR扩增，用GAPDH作为内参基因定量mRNA，用2-△CT计算相对表达水平。
　　1.5 CYP基因分型提取全基因组 DNA，根据文献报道在中国汉族人群中发生频率大于1%的基因多态性位点共25个，由华大基因用SNP MassARRAY进行分型检测。
　　1.6 CYP活性测定以非那西汀作为CYP1A2，香豆素作为CYP2A6，安非他酮作为CYP2B6，紫杉醇作为CYP2C8，甲苯磺丁脲作为CYP2C9，奥美拉唑作为CYP2C19，右美沙芬作为 CYP2D6，氯唑沙宗作为 CYP2E1，咪达唑仑作为CYP3A4/5的底物分别配制孵育体系，然后HPLC法检测孵育体系的代谢产物浓度。
　　1.7统计方法使用SPSS17.0统计软件进行数据的统计，Prism5.0软件作图，所有数据均进行正态性检验，其中大部分数据属于非正态分布，采用非参数检验的方法进行分析。检验水准设为P<0.05。
　　2结果：
　　2.1 Cyt b5含量
　　2.1.1 Cyt b5 mRNA107例人肝标本中Cyt b5 mRNA表达水平最小值0.61，最大值7.44，中位数1.59，差异倍数12倍。
　　2.1.2 Cyt b5蛋白123例人肝标本中Cyt b5蛋白含量最小值为33.75 pmol/mg，最大值为641.27 pmol/mg，中位数270.01 pmol/mg，蛋白含量也有较大的个体差异性，差异倍数为19。
　　2.2人口学因素对Cyt b5 mRNA表达水平和蛋白含量的影响
　　2.2.1人口学因素对Cyt b5 mRNA表达水平的影响根据性别、年龄（以45岁为界）、吸烟和饮酒对Cyt b5mRNA进行分组，分析这些原因对Cyt b5 mRNA的影响，发现性别、年龄、吸烟和饮酒均对Cyt b5mRNA无显著性影响。
　　2.2.2人口学因素对Cyt b5蛋白含量的影响根据性别、年龄（以45岁为界）、吸烟和饮酒对Cyt b5蛋白含量进行分组，分析这些原因对Cyt b5蛋白含量的影响，结果显示，男性中Cyt b5蛋白含量显著高于女性（P=0.002），吸烟组中Cyt b5蛋白含量显著高于不吸烟组（P=0.006），年龄和饮酒对Cyt b5蛋白含量没有影响。
　　2.310种 CYP基因分型结果25个 SNP位点等位基因的突变频率从1.1%(CYP3A4*18A)到69.4%(CYP3A5*3)，与文献报道的中国人的频率一致。
　　2.4 Cyt b5对10种CYP总体活性的影响
　　2.4.1 Cyt b5 mRNA表达水平对10种CYP总体活性的影响 Cyt b5 mRNA表达水平对5种CYP的酶动力学参数Vmax有显著影响（P<0.05），它们分别是CYP2B6（r=0.619）、CYP2D6（r=0.269）和CYP3A4/5（r=0.439）。Cyt b5的mRNA对3种CYP的酶动力学参数Km有显著影响P<0.05），分别是CYP2C8（r=0.236）和CYP3A4/5（r=0.223）。Cyt b5的mRNA对2种CYP的酶动力学参数Clint有显著影响（P<0.05），分别是CYP2B6（r=0.452）和CYP2D6（r=0.438）。其中，CYP2B6和CYP2D6的酶动力学参数Vmax、Clint同时受到Cyt b5 mRNA的影响，CYP3A4/5的酶动力学参数Vmax、Km同时受到Cyt b5 mRNA的影响。
　　2.4.2 Cyt b5蛋白含量对10种CYP总体活性的影响 Cyt b5的蛋白含量对7种CYP酶的动力学参数Vmax有显著影响（P<0.05），分别是CYP1A2（r=0.377）、CYP2B6（r=0.416）、CYP2C19（r=0.282）、CYP2D6（r=0.467）、CYP2E1（r=0.316）和CYP3A4/5（r=0.322）。Cyt b5的蛋白含量对8种CYP的酶动力学参数Clint有显著影响（P<0.05），分别是CYP1A2（r=0.343）、CYP2B6（r=0.391）、CYP2C9（r=0.240）、CYP2C19（r=0.283）、CYP2D6（r=0.375）、CYP2E1（r=0.352）和CYP3A4/5（r=0.197）。Cyt b5的蛋白含量对10种CYP的酶动力学参数Km均没有影响。
　　2.5 Cyt b5对10种不同基因型的CYP活性的影响
　　2.5.1 Cyt b5 mRNA表达水平对不同基因型的CYP活性的影响 Cyt b5 mRNA对CYP1A25347C>T、-3113A>G，CYP2A6*4，CYP2B6516G>T、785A>G，CYP2C8*1B、*1C，CYP2D6100C>T、1661G>C、2850C>T，CYP3A420070T>C、20230G>A及CYP3A5*3突变活性有显著影响（P<0.05）。
　　2.5.2 Cyt b5蛋白含量对不同基因型的CYP活性的影响 Cyt b5蛋白含量对CYP1A2-3860G>A、-163C>A、5347C>T、-3113A>G、2159G>A，CYP2A6*1B，CYP2B6516G>T、785A>G，CYP2C9*3，CYP2C19*2、*3，CYP2D6100C>T、1661G>C、2850C>T，CYP2E1-1293G>C、7632T>A、-333T>A、-352A>G,CYP3A420070T>C、20230G>A及CYP3A5*3突变活性有显著影响（P<0.05）。
　　3结论：
　　1. Cyt b5表达水平在正常人肝中存在大的个体差异。
　　2.性别和吸烟对Cyt b5蛋白含量有显著影响。
　　3. Cyt b5 mRNA和Cyt b5蛋白对人肝微粒体中CYP总体活性有显著影响。
　　4. Cyt b5 mRNA和Cyt b5蛋白对不同基因型CYP活性影响具有SNPs依赖性。