家蚕二分浓核病毒在昆虫细胞中的拯救

家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus, BmBDV）是首例拥有自身编码DNA聚合酶的ssDNA的无脊椎动物病毒，其基因组由两种ssDNA(VD1和VD2)所组成。该病毒专一性识别的宿主细胞为家蚕中肠组织的柱状上皮细胞，是致使家蚕慢性浓核病症的致病原，其复制机制尚不清楚。本课题主要在BmN和Sf9的昆虫细胞中进行，首次采用线性化共转染的方式，将该病毒的两种全长基因组片段VD1和VD2转染这两种昆虫细胞，并将转染后的昆虫细胞添食回感易感品系的家蚕幼虫，分别从病毒基因转录水平和表达水平，来检测转染后的昆虫细胞中能否通过这种方式产生具有感染性的病毒粒子。由此为该病毒基因组的各个基因的功能和遗传特性的研究奠定基础，并对该病毒的复制机制进行推测。
　　1、对线性化共转染后BmN细胞感染性的检测和培养方式的探索
　　通过酶切该病毒基因组全长的克隆质粒pT-VD1和pUC-VD2，利用酒精沉淀法收集带有特异性酶切位点的基因组片段VD1和VD2，线性化共转染BmN细胞，采用传代培养和持续培养两种方式，各培养20天。(1)以收集的细胞团和上清培养基为模板，进行PCR检测，在持续培养和传代培养的细胞团中扩增到病毒基因的条带。(2)提取细胞团和细胞培养上清的总蛋白进行Western blotting检测，在传代培养的细胞团中可杂交到与病毒蛋白相关的条带。(3)将转染后传代培养的BmN细胞吹下，进行间接免疫荧光检测，阳性反应定位于细胞核内。结果说明，线性化共转染的病毒基因组的DNA片段对BmN细胞具有感染性，在线性化共转染后采取传代培养的方式更有利于对BmN细胞感染性的研究。
　　2、转染后的BmN细胞中拯救病毒的回感检测
　　将收集的传代培养的BmN细胞团和细胞培养上清分别添食易感品系的家蚕306的二龄起蚕幼虫，饲养至五龄第四天。(1)抽提家蚕中肠组织的基因组，以及家蚕蚕粪的稀释液为模板，通过PCR检测，在添食BmN细胞团的基因组中均可扩增到病毒基因的条带。(2)提取家蚕中肠的总蛋白，通过Western blotting检测，只在添食细胞团的总蛋白中可杂交到与病毒基因表达有关的条带。结果说明，线性化共转染后的BmN细胞中产生了具有感染性的病毒粒子，可以使家蚕306幼虫发病。
　　3、对线性化共转染后Sf9和BmN细胞感染性的检测
　　将酶切后收集的基因组片段VD1和VD2，线性化共转染BmN和Sf9细胞，传代培养20天。(1)抽提转染后细胞的基因组，经去甲基化处理后，进行PCR检测，仅在BmN细胞的基因组中可扩增到病毒基因的条带，而在Sf9细胞的基因组中并未扩增到目的条带。(2)提取转染后细胞的总蛋白，通过Western blotting检测，只在BmN细胞的总蛋白中可杂交到与病毒蛋白有关的条带，而在Sf9细胞团的总蛋白中并未杂交到目的条带。结果说明线性化共转染的病毒基因组的DNA片段对Sf9细胞没有感染性，对BmN细胞则有感染性。
　　4、对转染后的Sf9和BmN细胞中拯救病毒的回感检测
　　将转染后收集的BmN和Sf9的细胞，分别添食易感品系家蚕菁松的二龄起蚕幼虫，饲养至五龄第四天。(1)抽提中肠组织的基因组，通过PCR检测，仅在添食BmN细胞组中可扩增到病毒基因的条带，而在添食Sf9的细胞组中并未扩增到目的条带。(2)提取家蚕中肠组织的总蛋白，通过Western blotting检测，只在添食BmN细胞团的总蛋白中可杂交到与病毒蛋白有关的条带，而在添食Sf9细胞团组的总蛋白中并未杂交到目的条带。结果表明，在BmN细胞中产生具有感染性的病毒粒子，可使得家蚕菁松发病，而在Sf9细胞中则并没产生具有感染性的病毒粒子。
　　由此表明，通过将BmBDV的基因组片段线性化共转染BmN细胞的方法，可以拯救出具有感染性的病毒粒子。