PGA固定化及其基因的真核表达研究

青霉素G酰化酶(penicillin G acylase，EC 3.5.1.11，简称PGA)可以催化青霉素G水解生成6-氨基青霉素烷酸(6-APA)，6-APA是生产半合成青霉素的重要中间体。因此，PGA具有重要的工业价值。 本文根据GenBank中已有的巨大芽孢杆菌PGA基因序列设计了上下游引物，通过PCR扩增出巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1741中PGA基因。将所得的PGA基因克隆至T71ac启动子控制下的表达载体pYES2(amp<'+>，ura<'+>)中，构建了表达质粒pYES2-PGA，并转化进酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158中表达，得到4株重组菌株Y1、Y2、Y3、Y4。在不需要苯乙酸诱导的发酵培养中，均在培养液中测到了青霉素酰化酶活性，其中Y4的酶活最高，达到0.75U/ml。如果再进行发酵培养等优化，还有提高酶活量的潜力。将pYES2-PGA进行测序，并将测序结果与GenBank中已有其它三株巨大芽孢杆菌的PGA基因序列比对，表现出很高的同源性，分别达到97.1％、99.8％和99.8％。 固定青霉素酰化酶在工业生产半合成抗生素中具有重要作用，本实验还采用包埋法将无机磁性粒子Fe<,3>O<,4>与有机材料海藻酸钠结合起来形成的一种复合磁性微胶囊，表面含有特征性功能基团。从而有效提高固定化青霉素酰化酶的稳定性和回收率。通过对青霉素酰化酶的固定化研究，优化了固定化参数：给酶量为333.3 U/g(干载体)，反应时问为4 h，pH为7.5，反应温度37℃。在此条件下固定化酶活性为173.6 u/g(干载体)，固定化效率为74.95％，活性回收率为52.08％，水解反应的最适pH为7.5，最适温度为40℃，且固定化酶的储存和多次实验操作稳定性良好。除此之外，测定了酶促反应的动力学常数：溶液酶和固定化酶的米氏常数分别为0.2415 mol/l和0.421 mol/l。