活血化瘀药丹参有效成分治疗非酒精性脂肪性肝炎的实验研究

目的：研究活血化瘀药丹参有效成分对非酒精性脂肪性肝炎的防治作用及其作用机制。
　　方法：采用肝脏原位胶原酶灌注法分离大鼠原代肝细胞。以大鼠原代肝细胞和人肝癌细胞株HepG2为研究对象，油酸和棕榈酸诱导原代肝细胞及HepG2非酒精性脂肪性肝炎模型。原代肝细胞及HepG2均分为正常对照组、油酸组、油酸+丹参酚酸B组、油酸+SP600125组、丹参酚酸B组、SP600125组、棕榈酸组、棕榈酸+丹参酚酸B组、棕榈酸+SP600125组、DMSO对照组。其中250umol/L，油酸及棕榈酸为原代肝细胞非酒精性脂肪性肝炎体外模型的刺激浓度，500umol/L油酸及棕榈酸为HepG2非酒精性脂肪性肝炎体外模型的刺激浓度，丹参酚酸B浓度为10-6mol/L；SP600125浓度为10umol/L。分别进行：
　　①油红O染色观察丹参酚酸B对FFA刺激细胞脂滴变化的影响；
　　②ELISA法检测丹参酚酸B对FFA诱导的细胞凋亡的影响；
　　③高内涵筛选Hoechst33258染色分析丹参酚酸B对FFA诱导的细胞凋亡的影响；
　　④Western blot法观察丹参酚酸B对FFA刺激的细胞内JNK、p-JNK表达的影响。
　　结果：
　　1.油红O染色结果显示：与正常对照组比较，油酸、棕榈酸均分别作用于原代肝细胞、HepG2细胞24h后，细胞内脂滴含量显著增加(P均<0.01)。丹参酚酸B、SP600125对正常培养的原代肝细胞、HepG2细胞内脂滴含量无明显影响，但显著减少油酸、棕榈酸诱导的原代肝细胞、HepG2细胞内脂滴含量(P<0.01，P<0.05)。原代肝细胞、HepG2细胞DMSO对照组与正常对照组比较，细胞内脂滴含量无统计学差异。
　　2.原代肝细胞、HepG2细胞凋亡的ELISA检测结果：与正常对照组相比，油酸组及棕榈酸组原代肝细胞、HepG2细胞吸光值[Absorbance(A405nm-A490nm)]显著增高，细胞凋亡明显(P均<0.01)；丹参酚酸B、SP600125对正常培养的原代肝细胞、HepG2细胞凋亡的抑制作用不明显，但显著抑制油酸、棕榈酸诱导的原代肝细胞、HepG2细胞凋亡(P<0.05，P<0.01)。原代肝细胞、HepG2细胞DMSO对照组与正常对照组比较，细胞凋亡程度无统计学差异。
　　3.高内涵筛选Hoechst33258染色观察原代肝细胞凋亡：正常对照组细胞核形态无明显变化，着色很浅或呈正常的蓝色，染色均匀；油酸组及棕榈酸组肝细胞凋亡明显，表现为细胞核明显减小(核固缩)，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。与正常对照组比较，油酸、棕榈酸组细胞核平均荧光强度值及凋亡率明显增高(P均<0.01)。丹参酚酸B、SP600125对正常培养的原代肝细胞核平均荧光强度值及凋亡率无明显影响，但显著降低油酸、棕榈酸刺激的原代肝细胞细胞核平均荧光强度值及凋亡率(P<0.05，P<0.01)。DMSO对照组与正常对照组比较，细胞核平均荧光强度值及凋亡率无统计学差异。HepG2细胞检测结果与原代肝细胞趋势一致。
　　4.Western blot检测结果显示，油酸、棕榈酸、SP600125、丹参酚酸B对原代肝细胞及HepG2细胞JNK的蛋白表达均无明显影响。但2h、24h原代肝细胞p-JNK(磷酸化JNK)表达结果：与正常对照组比较，油酸、棕榈酸均可显著促进p-JNK的表达(P均<0.01)。SP600125、丹参酚酸B对正常培养的2h、24h原代肝细胞p-JNK表达无明显影响，但对经油酸、棕榈酸刺激的2h、24h原代肝细胞p-JNK的表达均有显著抑制作用(P均<0.01)。DMSO对照组与正常对照组比较，p-JNK蛋白表达无统计学差异。2h、24hHepG2细胞p-JNK检测结果与原代肝细胞趋势一致。
　　结论：
　　1.丹参酚酸B能够抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡，改善其刺激的细胞内脂质代谢紊乱。
　　2.丹参酚酸B抑制JNK的活化，可能是其防治非酒精性脂肪性肝炎的重要分子机制之一。