【背景】
牙科种植技术已成为牙列缺损或缺失的重要修复方法之一，但牙种植体相关感染仍是严重威胁，带来一系列并发症。种植体相关感染高发的原因主要有两点：一是菌斑容易在种植体表面聚集且一旦形成很难去除；二是由于种植体的生物活性尚不理想，在种植体骨结合界面存在乏血管的纤维层使局部宿主抵抗力低下。因此，针对这两点在种植体表面制备同时具有抗菌和高生物活性双功能的涂层对于预防种植体相关感染，延长其使用寿命具重要意义。
人体自然组织是由纳米模块组装起来的，因此从仿生学的角度来看纳米结构应该具有更好的生物活性。二氧化钛（TiO2）纳米管（NT）制备工艺简单而且它用电化学处理制备，适合应用于形状复杂的种植体表面。TiO2-NT的管径可在几十到几百纳米范围内变化，有利于筛选适合不同组织结合的纳米尺寸。此外，TiO2-NT结构能够模拟骨组织中胶原原纤维的尺寸和排列，并且具有和骨组织相近的弹性模量。因此，通过优化TiO2-NT结构有希望获得理想的生物活性。
阻止种植体表面生物膜形成最有效的办法是预防细菌的早期粘附，因为生物膜一旦形成很难去除。从这个角度出发，抗菌涂层特别是载抗菌剂的涂层是一个有效途径。TiO2-NT很好的一个优点是它可作为药物的载体，因此通过载入合适的抗菌剂可获得抗菌能力。多种不同的抗生素都被尝试用于抗菌涂层的制备，但抗生素的使用所带来的产生耐药菌株的风险严重限制了它们的应用。经过文献回顾我们认为银是制备抗菌涂层的较为理想的选择。银具有多方面的优点如广谱抗菌能力甚至包括某些抗生素耐药菌、在合适的浓度时很好的生物相容性、良好的稳定性以及产生耐药菌的风险小等。此外，由于银抗菌的有效浓度很低，可以通过在TiO2-NT中载入足够多的银和控制释放速度获得长期抗菌能力。
【目的】
探明影响TiO2-NT生物活性的因素，基于TiO2-NT筛选和研发具有更好生物活性的结构；探索纳米结构调节细胞功能的机制，为进一步指导种植体表面设计提供理论基础；摸索合适的方法将银载入TiO2-NT中以获得长期抗菌能力；鉴于干细胞在骨结合中的更重要的作用，研究TiO2-NT与干细胞的相互作用，为更合理的种植体表面设计提供依据；体内试验验证这些结构的效果。
【方法】
1）用阳极氧化方法在0.5wt％氢氟酸（HF）溶液中制备TiO2-NT，场发射扫描电镜（FE-SEM）观察制备的TiO2-NT的管径大小、管的完整性和膜的均匀程度等。观察阳极氧化电压和时间对形成的TiO2-NT的影响；2）采用大鼠原代成骨细胞体外培养的方法评价5VTiO2-NT（5VNT）和20VNT的生物活性。检测不同电压所形成的TiO2-NT的表面能差异，用DAPI染细胞核然后计数细胞粘附，MTT法测细胞活性，免疫荧光染色和SEM观察细胞形态，试剂盒检测细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，实时定量PCR检测成骨相关基因的表达；3）评价5VNT和20VNT经高温高压、紫外照射和酒精浸泡消毒后生物活性的差异。测量不同方法消毒后试样表面能的差异，试剂盒检测其蛋白吸附能力以及细胞培养液中LDH活性，用前面述及的方法检测细胞粘附、活性、胞内ALP活性和总蛋白含量以及成骨相关基因的表达，天狼星红染色法检测细胞胶原分泌，茜素红染色法检测细胞外基质（ECM）矿化；4）采用酸蚀加阳极氧化处理的方法制备微米坑/纳米管梯度形貌，并用体外成骨细胞培养的方法评价该仿生梯度形貌的生物活性；5）以成分为碳化钛/碳壳核结构（TiC/C）或表面成分为TiO2的准平行竖直排列的纳米线阵列(QANWAs)为模型，用体外成骨细胞培养的方法探索纳米结构调节细胞功能的机制；6）硝酸银浸泡加光照还原的方法将银纳米颗粒载入TiO2-NT中，控制硝酸银的浓度和浸泡时间载入不同量的银，体外评价其长期抗菌能力和生物相容性；7）体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），观察TiO2-NT以及微米/纳米梯度结构在无成骨诱导培养基（OS）的情况下对MSCs成骨分化的影响。CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，观察细胞内ALP活性和总蛋白含量、胶原分泌和ECM矿化和基因表达水平。阻断ERK1/2、JNK和PI3K/Akt信号通路后观察胶原分泌和ECM矿化；8）观察OS对钛和细胞培养板（TCP）表面培养的MSCs成骨分化的影响；9）体内试验验证试样的体内效果。
【结果】
1）成功制备均匀分布的TiO2-NT结构，管径与阳极氧化电压正相关，在3-20V的电压下进行阳极氧化分别形成管径20-100nm的TiO2-NT阵列；2）在TiO2-NT表面早期细胞粘附未受明显影响，与抛光钛相比TiO2-NT提高成骨细胞ALP活性并诱导更多的ECM沉积。细胞紧密地粘附到抛光钛表面并且互相接触，几乎完全覆盖整个表面，在5VNT表面细胞伸出结实的板状伪足，而在20VNT表面细胞伸出大量纤细的丝状伪足。细胞生长略受抑制，但细胞成骨相关功能基因的表达受到明显抑制特别是在20VNT表面；3）与高温高压消毒相比，紫外照射和酒精浸泡消毒试样的表面自由能较高，细胞粘附和增殖较好。其中紫外照射消毒表面的细胞功能最好，包括细胞粘附、增殖以及以ECM沉积及矿化和成骨相关功能基因的表达为标志的细胞分化。不同消毒方法的使用影响对纳米形貌和抛光对照之间的生物活性的对比。如高温高压消毒后TiO2-NT表面的细胞早期粘附数量较多，但当用紫外照射或酒精浸泡消毒时这一差异消失。当采用酒精浸泡消毒时20VNT表面的细胞增殖比其它两个试样好，但当采用紫外照射或高温高压消毒时三个试样表面的细胞增殖无差异；4）成功制备微米坑/纳米管梯度仿生形貌。发现酸蚀微米形貌对成骨细胞功能的促进作用不均衡，虽然细胞早期粘附和成骨相关功能基因的表达得到促进，但细胞其它功能被抑制。在微米形貌上加入纳米管之后同时促进或保持成骨细胞的多个功能；5）成功制备TiC/C和TiO2两种不同表面成分的QANWAs，TiC/CQANWAs为超疏水性而TiO2QANWAs与光滑对照相比更加亲水。QANWAs阻碍细胞粘附导致细胞凋亡，其它的细胞功能如增殖和分化也明显受到抑制。QANWAs的细胞排斥特性主要来源于它们的特殊结构，不受表面化学成分和表面润湿性的影响，也并非源于蛋白吸附量的降低；6）通过硝酸银浸泡加光照还原的方法成功制备载银纳米管（NT-Ag），银纳米粒子紧密地粘附到纳米管的内壁，并且银纳米粒子的大小可以通过控制硝酸银的浓度和浸泡时间来调整。NT-Ag在第一周内可有效杀灭种植体周围浮游细菌，而其预防活细菌粘附的能力在观察的两周内无明显下降；7）首次系统地观察了TiO2-NT、酸蚀形貌、微米/纳米梯度形貌在不使用OS的条件下对MSCs成骨分化的影响，发现所有的这些形貌均可在无OS的情况下诱导MSCs成骨分化。其中，20VNT和Micro/20VNT诱导MSCs成骨分化的能力最强；8）在TCP表面OS的使用略微抑制MSCs增殖但明显促进以胶原分泌和ECM矿化为代表的MSCs分化。而在钛表面，OS仍就抑制MSCs增殖且该作用与TCP表面相比稍微明显一些，但细胞分化并未像在TCP表面那样受到促进而是遭到显著抑制，细胞内ALP活性和总蛋白含量、胶原分泌和ECM矿化均降低。OS在钛表面对干细胞分化的抑制作用与其表面形貌无关；9）体内预实验结果表明20VNT在早期可促进种植体骨结合。
【结论】
1）可以通过简单的阳极氧化方法在钛表面制备不同管径（20-100nm）的TiO2-NT，从而可以筛选适合不同组织结合的纳米尺寸。
2）TiO2-NT尤其是较大管径的纳米管抑制原代成骨细胞的某些功能如成骨相关功能基因的表达，原因在于TiO2-NT阻碍其表面细胞粘着斑的组装。原代成骨细胞与细胞系表型的不一致使它们对TiO2-NT的反应不同，可能是目前关于TiO2-NT生物活性存在争议的原因。
3）消毒方法明显影响TiO2-NT的表面特性从而影响其表面成骨细胞功能。各试验中使用的不同消毒方法影响对纳米形貌和抛光对照之间的生物活性的对比，提示消毒方法的不一致是目前关于TiO2-NT生物活性的报道出现争议的一个重要原因。其中紫外照射消毒表面的细胞功能最好，原因在于紫外照射消毒能有效去除试样表面的碳氢污染。
4）酸蚀微米形貌对成骨细胞功能的促进作用不均衡，在微米形貌上加入纳米管之后更平衡地促进或保持成骨细胞的多个功能。该结果首次揭示了微米和纳米形貌对细胞功能的协同作用，提示微米/纳米梯度结构可能从生物学的角度来讲更合理，这对种植体表面设计具有很大指导意义。
5）QANWAs阻碍细胞粘附导致细胞凋亡，原因可能在于对细胞粘着斑组装的阻碍。该结果提示纳米形貌包括TiO2-NT调控细胞功能的一个重要机制就是调节细胞粘附，包括整合素的簇集和粘着斑的组装和成熟。
6）通过简单的硝酸银浸泡加光照还原的方法可以制备NT-Ag。载有适量银的NT-Ag在早期一周内可有效杀灭种植体周围浮游细菌，而其预防活细菌粘附的能力在观察的两周内无明显下降，提示NT-Ag的长效抗菌能力。虽然NT-Ag表现出一定的细胞毒性，但在接下来的试验中我们可以通过缩小管口等方法控制银的释放速率以消除细胞毒性。
7）20VNT和微米/20VNT梯度形貌诱导干细胞成骨分化的能力最强。形貌因素的骨诱导能力源于它们对细胞粘着斑以及接下来的机械转导的调节。ERK1/2、JNK和PI3K/Akt均参加了微米/纳米形貌表面的细胞信号转导，但其作用有一定差别。
8）OS的作用在不同生物材料的研究中不同，原因在于OS和生物材料表面信号可能通过共同的机制调节细胞功能从而会发生相互作用。该结果提示需要重新考虑OS的概念以及它在生物材料研究中应用的合理性。
9）初期体内试验结果表明20VNT在早期可促进种植体骨结合。
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