木质纤维素水解液抑制物高抗性酵母的选育

纤维素水解液抑制物对微生物的毒害作用是纤维素乙醇发展面临的主要瓶颈问题之一。本文主要借助分子生物学相关手段和进化工程方法来选育纤维素水解液抑制物抗性提高的酵母菌株。一方面，通过基因工程改造等手段实现膜转运蛋白基因的过表达来构建抗性提高的酿酒酵母;另一方面，通过定向驯化的方法来筛选得到具有良好抑制物抗性的酵母菌株。
　　首先，利用基因工程改造相关手段获得膜转运蛋白基因ADP1，STE6, MDR1，TPO1过表达的酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae280/959-PGK-ADP1/MDR1/STE6/TPO1和空载对照菌株S.cerevisiae280/959-PGK。并通过抑制物胁迫条件下的梯度稀释实验和发酵实验进行验证，结果表明:在甲酸、乙酸、糠醛等抑制物胁迫条件下，过表达菌株S.cerevisiae280-PGK-MDR1和S.cerevisiae959-PGK-ADP1在生长速率、耗糖速率、乙醇生产强度等方面与其对照菌株相比具有明显优势。
　　其次，本研究利用进化工程的方法对酿酒酵母模式菌株S.cerevisiae959在含有甲酸、乙酸的条件下分别进行了定向驯化，并将驯化后的菌株进行抑制物抗性的考察和验证。结果表明，驯化后的菌株在相应抑制物的胁迫条件下仍然可以以较快的速率生长，消耗葡萄糖并生成乙醇。此外，经过甲酸驯化后的菌株对乙酸和混合酸的抗性也得到了提高，而经过乙酸驯化的菌株在甲酸或混合酸存在的条件下与对照菌株相比并没有特别明显的优势。
　　在上述实验的基础上，本研究对能够天然利用多种碳源（己糖和戊糖）的马克斯克鲁维酵母进行了定向驯化，其驯化条件为模拟纤维素水解液中的混合抑制物条件，同时对驯化后的菌株进行了抑制物抗性的考察和发酵实验验证。结果表明，驯化后的菌株与出发菌株相比，对纤维素水解液抑制物的抗性显著提高。此外，经过驯化后的菌株K.marxianus1727-1和K.marxianus1727-5不仅在抑制物抗性方面表现出明显优势，对木糖的消耗速率也有了显著提高。
　　最后，选取驯化后菌株优势最为明显的K.marxianus1727-5进行基因组重测序。测序结果表明，驯化后的菌株不仅在表型上发生了变化，在基因水平上也有明显的变化。特别是SNP分析的结果涉及了一些关键的糖代谢基因、转录因子和转运蛋白的突变，这些基因的发现不仅很好地解释了K.marxianus1727-5表型发生变化的原因，更重要的是为我们深入揭示相关抑制物抗性的分子机理提供了重要的参考依据。