NLRP3/Il-1β和Il-18在哮喘小鼠肺组织中表达及与气道炎症关系

研究背景:支气管哮喘是由多种细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，并与气道高反应性相关。哮喘的发病机制极为复杂，迄今尚未阐明，目前普遍被接受的发病机制有以下几种:①气道慢性炎症学说;②Th1/Th2失衡理论;③机体免疫耐受功能缺陷学说;④调节性淋巴细胞学说，其内容主要包括:免疫系统中的CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞，Th17细胞等，通过调节淋巴细胞，发挥激活或抑制作用参与气道炎症。但是，近年来从临床观察和基础研究表明，现存的理论并不能完全解释哮喘的发病机制，哮喘的治疗仍面临许多难题。
　　 NLRP3炎症复合体是一种细胞质内的多蛋白聚合物，主要由核苷酸结合寡聚化结构域受体(NLRP3)、半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)、凋亡相关点样蛋白(ASC)组成，是caspase-1活化所必需的平台，调控IL-1β、IL-18、IL-33等促炎细胞因子的修饰与活化，进而影响获得性免疫反应。NLRP3炎症复合体主要在巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞中表达。其中，NLRP3是细胞胞浆内重要的模式识别受体，能感知胞内病原微生物及代谢物，起始炎症复合体的组装，是构成炎症复合体的核心部分。
　　 IL-1β、IL-18、IL-33属于IL-1家族，其中IL-1β又名前炎症反应细胞因子，主要由单核巨噬分泌，具有刺激单核细胞及促进嗜酸性粒细胞脱颗粒作用。IL-1β可促进Th17细胞分化、维持Th17相关细胞因子的产生，也可促进嗜酸性粒细胞的募集。IL-18则能促进T细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞分泌IL-4、IL-13，同时增强Th1介导的免疫应答。Harada等研究发现IL-18基因多样性与哮喘的恶化程度密切相关。IL-33可以促进Th2介导的应答，而Th1、Th2、Th17应答及嗜酸性细胞的募集，在支气管哮喘中发挥重要作用。近来国外文章相继报导了NLRP3炎症复合体与哮喘的关系，但作用机制到底如何目前尚没有定论。
　　 通过卵蛋白诱导哮喘小鼠模型，观察哮喘小鼠肺组织中NLRP3及其下游因子IL-18、IL-1β在肺组织中的表达及使用NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲后对哮喘气道炎症的影响，并分别对1L-1β、IL-18与肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞百分比(EOS％)进行相关性分析，以探讨NLRP3/IL-1β、IL-18通路在哮喘发病机制中的作用。
　　 第一部分哮喘动物模型的建立及验证
　　 目的:建立卵蛋白(OVA)致敏和激发的C57BL/6哮喘小鼠模型。
　　 方法:6周龄雌性C57BL/6小鼠21只，体重18-20g，由南方医科大学实验动物中心提供，按随机数字表法随机分为3组，每组7只，分别为:正常对照(A)组、NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲(B)组和哮喘(C)组，每组7只。B组和C组于实验第0天、7天、14天分别腹腔注射OVA及明矾缓悬液共0.2ml致敏，第21天～27天连续雾化吸入1％OVA40ml激发，每次30min，1次/d;B组每次雾化激发前30min腹腔注射格列本脲500mg/kg;A组用生理盐水替代OVA致敏和激发。末次激发24h后，各组小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱300μl，依次由低浓度开始激发0、3.125、6.25、12.5、25、50g/L，各浓度雾化后用BUXCO无创肺功能检测仪检测3min，记录气道反应性指标增强呼气间歇(Penh)值。Penh值=（呼气峰流速/吸气峰流速）×呼气间歇;Penh值越高，气道反应性就越高。各组小鼠最后1次激发30h后，摘右侧眼球取血。小鼠仰卧固定，开胸，分离暴露小鼠气管，用22号留置针行小鼠气管插管，冷PBS0.3ml×3进行肺泡灌洗，回收率在60％以上。肺泡灌洗液4℃1500r/min离心5min，取细胞沉渣进行细胞计数;而后瑞特-吉姆萨染色，对嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数。取右上肺组织，4％多聚甲醛固定24h后，酒精脱水，石蟮包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色。
　　 统计学分析:采用SPSS16.0统计软件分析数据。实验结果以均数±标准差((x)±s)表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，方差齐时采用Bonferroni法进行多重比较，方差不齐是采用Welch法进行分析，Dunnett'3进行多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.致敏及激发过程中小鼠行为学观察:哮喘组、格列本脲组在第二次致敏10min后出现不同程度的呼吸急促，立毛，趴在原地，活跃明显减低，整个过程持续约3个小时，对照组未为出现上述表现。B、C组小鼠在雾化激发后出现不同程度的头面部瘙痒、前肢搔鼻、烦躁不安、口唇紫绀，而A组无明显上述症状。
　　 2.哮喘小鼠气道反应性观察:从乙酰甲胆碱浓度为12.5g/L开始，哮喘组Penh值高于正常对照;在乙酰甲胆碱浓度为50g/L时，格列本脲组的Penh值高于对照组，差异有统计学意义;在所激发浓度下，哮喘组和格列本脲组之间，差异无统计学意义。
　　 3.哮喘小鼠BALF中白细胞计数改变:哮喘组BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞百分比、淋巴细胞百分比分别为[(29.88±4.97)×104/ml，(21.67±4.83)％，(31.87±5.31)％]均明显高于格列本脲组[(17.30±1.19)×104/ml，(12.45±1.12)％，(17.16±0.97)％，P＜0.05]及对照组[(9.74±2.88)×104/ml,(1.15±0.26)％，(10.66±1.83)％，P＜0.05]，而格列本脲组比对照组高。
　　 4.哮喘小鼠病理组织学观察:对照组小鼠肺组织支气管和肺泡结构完整，基本无炎症细胞浸润;哮喘组、格列本脲组肺泡间隔部分断裂，支气管壁周围较多炎症细胞浸润，多为淋巴细胞，格列本脲组炎症较哮喘组减轻。
　　 结论:
　　 根据不同组小鼠的气道反应性结果、肺泡灌沈液细胞总数及细胞分类计数结果、肺组织病理结果，证明OVA致敏和激发的C57BL/6哮喘小鼠模型建立成功。哮喘小鼠经格列本脲干预后气道炎症有所减轻。
　　 第二部分:NLRP3/IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺组织中表达及与气道炎症关系
　　 目地:探讨NLRP3/IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺组织中的表达及与气道炎症的关系。
　　 方法:6周龄雌性C57BL/6小鼠21只，体重18-20g，由南方医科大学实验动物中心提供，按随机数字表法随机分为3组，每组7只，分别为:正常对照(A)组、NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲(B)组和哮喘(C)组，每组7只。哮喘模型的制作方法及过程同第一部分内容。造模后检测小鼠气道反应性、苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理改变及计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸细胞百分比、淋巴细胞百分比以了解各组小鼠的气道炎症程度。Western blot检测肺组织NLRP3表达:取肺组织100mg,用冰冻的PBS液冲洗1遍，滤纸吸干，剪刀剪碎后，加入预冷的裂解液1ml，冰磨3min，至不见组织碎块，离心取上清，-80℃冻存。采用BCA法测定蛋白含量。使用前各组蛋白分别取50μg，SDS-PAGE电泳和免疫印记反应，半干法转膜，最后用ECL发光剂荧光显色，在成像系统曝光观察蛋白条带，并用ImageJ software分析条带灰度值。RT-PCR检测肺组织NLRP3 mRNA表达:提取总小鼠肺总RNA，逆转录为cDNA，以1μL cDNA为模板行PCR扩增，实时定量PCR样品反应体系采用SYBRGreen I，其最终的反应体系为25uL。循环条件为:95℃10min，＜95℃10s，60℃30s，40℃5s进行45个循环。得到各自的荧光域值循环数(Ct值)后，采用相对定量法2-△△CT进行计算。 ELISA方法检测小鼠肺组织匀浆上清IL-1β、IL-18表达:取余右肺组织，预冷的PBS冲洗后滤纸吸干，称重，剪刀剪碎后，加入PBS液，冰磨2min至不见组织碎块离心取上清，BCA法测定蛋白含量，-80℃冻存。临用前参照试剂盒说明书进行IL-1β、IL-18的检测。并分别对IL-1β、IL-18与BALF中嗜酸性粒细胞百分比进行相关性分析。
　　 结果:
　　 1.哮喘小鼠肺组织中NLRP3蛋白的表达结果:Western Blot检测哮喘组肺组织NLRP3蛋白的表达均高于格列本脲组、对照组（均P＜0.05）;而格列本脲与对照组之间差异没有统计学意义。
　　 2.哮喘小鼠肺组织NLRP3 mRNA的表达统计结果:RT-PCR检测哮喘组肺组织的NLRP3 mRNA表达均高于格列本脲组、对照组(均P＜0.05)，差异有统计学意义;而格列本脲组与对照组差异没有统计学意义。
　　 3.哮喘小鼠肺组织中IL-1β和IL-18的变化:哮喘组肺组织匀浆上清IL-1β(74.81±17.45) pg/mg及IL-18(426.94±76.05)pg/mg含量均高于对照组[(37.54±5.53) pg/mg,P＜0.05;(249.62±161.20) pg/mg,P＜0.05]，而格列本脲组与其他两组相比差异没有统计学意义。
　　 4.IL-1β、IL-18与嗜酸性粒细胞百分比呈正相关。
　　 结论:NLRP3及其下游因子IL-1β、IL-18在哮喘小鼠肺组织中高表达，采用NLRP3抑制剂格列本脲进行干预后哮喘小鼠气道炎症减轻，且IL-1β、IL-18与BALF中肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞百分比呈正相关，提示NLRP3/IL-1β、IL-18通路可能在气道炎症的形成中发挥着重要作用。