布拉氏酵母URA3/TRP1双营养缺陷株的构建及鉴定

布拉氏酵母(S.boulardii)是法国科学家Henri Boulard于1920年从印尼荔枝等水果中分离得到的一种益生酵母菌。自从1982年DuCluzeau等首先报道了布拉氏酵母的益生性后，布拉氏酵母作为益生菌就得到了广泛的研究。现在布拉氏酵母已被广泛的用作预防和治疗腹泻及肠道菌群失调的药物。布拉氏酵母作为益生菌，虽然有很好的益生作用，但其不能在肠道内定植等缺陷也严重限制了其更广泛的应用。
　　基因敲除技术在生物遗传操作方面的应用得到了人们的广泛认可。应用该技术可以在分子水平上研究基因的功能，改造生物的遗传性状。对于布拉氏酵母而言，我们可以通过基因敲除技术，对其遗传性状加以改造，以期获得能够在肠道内定植、益生作用更好的菌株，从而大大提高其应用范围。
　　在近些年关于布拉氏酵母的研究报道中，主要集中于其在生产应用方面的研究，很少是关于其分子机制的研究。由于布拉氏酵母生活史的特异性，它不能形成单倍体的孢子，也没有天然的营养缺陷型菌株，这就使得已经成熟应用于酿酒酵母的遗传操作系统不能直接应用到布拉氏酵母中。因而，在对布拉氏酵母的遗传操作过程中，就不得不选用抗生素基因来作为标记基因，然而应用抗生素基因，极易造成抗生素基因的污染，致使抗生素丧失其杀菌功能，对病原微生物的防治造成极大的不便。基于抗生素作为遗传标记的诸多危害，本实验室就使用抗生素作为遗传标记构建布拉氏酵母的基因敲除系统，以此系统敲除布拉氏酵母的相应基因，构建其营养缺陷型菌株。此营养缺陷型菌株在以后的遗传操作中，就可以作为筛选标记。在我们实验室，应用此系统已经成功构建了布拉氏酵母的URA3的营养缺陷型菌株，然而考虑到布拉氏酵母是二倍体菌株，单一的营养缺陷型不足以满足布拉氏酵母遗传操作的需要，因此，我们就在URA3营养缺陷菌株的基础上，再敲除TRP1基因，以构建URA3/TRP1双营养缺陷型菌株，进一步完善布拉氏酵母的基因敲除系统。
　　本实验的主要目的是，在已经敲除URA3基因的布拉氏酵母中继续敲除TRP1基因，以构建URA3/TRP1双营养缺陷型变异株。在TRP1的敲除过程中，选用抗生素潮霉素B(HygB)来作为选择标记，用PCR反应扩增已经构建好的HygB基因两端带有loxP位点的PZC1质粒来构建基因敲除盒，该基因敲除盒两端各有一个短的可以同源重组到TRP1基因位点的DNA片断，然后诱导本实验室构建的loxP∷ble∷loxP/Cre重组酶系统（本文中简称Cre质粒）表达将阳性菌株中的HygB基因切除。在本实验中，我们用PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳来检测基因敲除盒的构建、敲除盒对TRP1基因的敲除以及抗生素基因的删除情况，最后用色氨酸缺陷培养基SD-CAA培养变异株验证TRP1基因的敲除情况。应用此方法我们成功构建了布拉氏酵母的URA3/TRP1双营养缺陷株，此变异株既可以用于其它相关基因操作的筛选标记，也可以用来作为基因工程疫苗的载体。