毛霉Δ<'6>-脱饱和酶基因及其5'端侧翼区域的克隆与功能鉴定

γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸。利用苏丹黑染色法筛选获得一株高产GLA的霉菌EIM-10，以酸水解法对其进行油脂提取，甲酯化后以气相色谱-质谱联用仪进行了分析，γ-亚麻酸占总脂肪酸的27.68％。为进一步鉴定该菌株，克隆测定了该菌18SrRNA基因序列。系统进化分析表明该菌株属于毛霉属。 进一步应用RT-PCR技术，扩增出所分离的γ-亚麻酸高产菌株EiM-10的△6-脂肪酸脱饱和酶基因(MCD6)，并连接到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0，在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMCD6，转化酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1，通过尿嘧啶缺陷型选择性培养基筛选阳性克隆子。加入外源底物亚油酸，半乳糖诱导表达后通过气相色谱-质谱联用仪对转化酵母进行脂肪酸分析，结果表明，△6-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。 为进一步了解△6-脂肪酸脱饱和酶基因转录调控的分子机制，通过LA-PCR方法，从Mucor sp.EIM-10中扩增得到696 bp的△6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物，对该产物进行克隆和测序，将测得的序列在多个转录因子、启动子数据库中进行比对分析并应用多种计算机软件和多个启动子在线预测网站等进行分析，发现其可能为潜在的启动子区域，该序列具有真核启动子序列的基本结构特征。将Mucor sp.EIM-10△6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端上游区基因序列(599 bp)提交GenBank数据库。 利用GFP(绿色荧光蛋白基因)为报告基因，在大肠杆菌及酿酒酵母穿梭质粒载体pYES2.0的基础上构建具有鉴定真核基因启动子功能的穿梭质粒载体pYGFP，本文构建的穿梭质粒载体既可以在大肠杆菌中扩增，又可以在酵母中实现表达，操作快速、简便，具有更好的应用前景。 应用前文中构建的具有鉴定真核基因启动子功能的穿梭质粒载体pYGFP，将前文中克隆的Mucor sp.EIM-10△6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域插入到pYGFP载体中构建重组载体pYD6GFP。将重组载体pYD6GFP转化酿酒酵母，挑取阳性克隆子在SC-U液体培养基中培养24～30 h后，在一定激发波长的荧光显微镜下观察。结果显示阳性克隆子在荧光显微镜下有明显的绿色荧光，说明GFP基因在酵母中得以表达，而△6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域具有启动子功能。 为了进一步研究△6-脂肪酸脱饱和酶基因的表达调控，将△6-脂肪酸脱饱和酶基因(MCD6)置于其5’端侧翼启动子的下游，构建重组质粒pYD6MCD6，将重组载体pYD6MCD6转化酿酒酵母，按照同样的方法筛选、培养阳性克隆子后，通过气相色谱-质谱联用仪对转化酵母进行脂肪酸分析，结果表明，在酿酒酵母中，△6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子区域同样能启动△6-脂肪酸脱饱和酶基因的表达。