心肌营养素1在缺氧后适应中对心肌保护作用的探讨

随着人们物质生活水平不断提高，不健康的生活方式逐渐增多，威胁人类健康的疾病谱也随之发生改变。近10年来，在我国冠心病发病率增加了2-3倍，急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)发生率增加了2倍以上，冠心病成为继肿瘤和脑血管疾病之后的第三位人类健康杀手。因此，治疗急性心肌梗死、抢救濒危患者的生命就显得尤为重要，而且任务艰巨。目前治疗急性心肌梗死不外乎以下三种方法:经典药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗以及冠状动脉旁路移植术治疗。经过长期的临床观察发现，不论选择哪一种治疗方式，AMI患者在开通病变血管恢复远端供血以后，心肌梗死面积都进一步扩大，心脏舒张和收缩功能也会发生障碍，或者出现严重的心律失常，甚至导致死亡，这就是心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury，MIRI)现象。所以，缓解心肌再灌注损伤已经成为AMI治疗过程中迫切需要解决的问题。
　　 1986年，Murry等提出心肌在经受多次短暂重复心肌缺血再灌注后能够预防或者减轻随后的长时间缺血所致的心肌损伤，即缺血预适应(IschemicPreconditioning，IPC)。随后的临床研究证实了其心肌保护作用，但是因为操作问题和伦理原则导致临床应用受到限制。2003年赵志清等首先发表了关于缺血后适应(Ischemic Postconditioning， Postcon)的研究报道，证实用缺血再灌注模型，在冠状动脉再灌注开始前进行短暂、重复的开通及关闭，随后可以恢复冠状动脉血流，该措施能够限制心肌梗死的范围、减轻缺血心肌组织水肿和中性粒细胞聚集、改善内皮细胞的功能。因此，Postcon可能成为解决再灌注损伤这一问题的有效的途径之一。Postcon即心肌缺血后再灌注时进行短暂重复的开通及再闭，随后完全恢复血流，其保护机制是一个多因素参与的复杂过程。无论从动物实验模型、临床实验还是细胞实验，Postcon的心肌保护作用都已经得到充分的证明。Postcon的处理方法，由于其时间可预测、操作相对简单，使得其较缺血预适应更适合于临床治疗，它的应用前景也更为广阔。然而，Postcon通过何种机制减轻MIRI尚无明确结论。随着对缺血后适应研究的不断深入，有许多学者对Postcon的心肌保护机制提出各种假说，如再灌注损伤生存激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)途径（主要由磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K-Akt和细胞外信号调节激酶ERK1/2构成），线粒体ATP敏感性K通道(KATP)，以及线粒体通透性转换孔道(mitochondrial permeabilitytransition pore，mPTP)等等。Postcon心肌保护机制至今尚未被完全阐明，目前公认的机制包括减少氧自由基的产生，抑制线粒体内钙超载和减轻内皮功能失调等被动机制，再灌注损伤生存激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)途径的激活和其他蛋白激酶的产生等主动机制，多数学者认为主动机制在心肌保护中占主要地位。RISK途径主要由促生存激酶磷脂酰肌醇3-激酶-Akt通路（phosphatidy lionsitol3-kinase-Akt，PI3K-Akt）和促进细胞分裂蛋白激酶(mitogen-aetivated protein kinase，MEK1/2)-细胞外信号调节激酶ERK1/2(MEK1/2-ERK1/2)通路构成。Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，目前被认为是Postcon的关键酶之一。内皮型氧化亚氮合酶(eNOS)是PI3K-Akt途径的主要下游靶点，激活的Akt主要通过促进下游底物如合成酶激酶-3B等的磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞生存等功能。Postcon激活了Akt的磷酸化，增加了线粒体通透性转换孔道(mPTP)对钙离子超载的抵抗从而发挥保护作用。
　　 多数学者认为Postcon无论从主动还是被动渠道的激活均可使细胞的坏死或凋亡情况减轻，因此对于心肌细胞保护因子的研究成为热点。作为心脏靶向的细胞因子心肌营养素1(CT-1)就是其中一员，CT-1是Pennica在1995年首次从小鼠心脏胚胎干细胞中克隆得到的细胞因子，具有促使体外细胞肥大的作用。随后的研究发现CT-1属于白细胞介素6(IL-6)超家族一员，存在于多种组织，在心肌细胞中表达最高，也是迄今为止能在体外诱导心肌细胞肥大最强的细胞因子。CT-1水平的正常表达对心脏的正常发育，维护心脏的正常功能起关键作用，大量的研究发现CT-1参与心肌梗死后的修复过程，减轻由缺氧复氧而引起的细胞损伤，从而明显改善左室舒缩功能，缩小梗死面积。Al-Mazroua，HA等研究发现左心室收缩功能不全的患者血浆CT-1水平显著高于正常人，CT-1的水平与左心室衰竭的严重程度也有关，这提示血浆CT-1浓度可能是反映心衰严重程度的敏感指标。CT-1如何参与Postcon心肌的保护作用尚不完全清楚，李菊香等的研究已经发现CT-1能通过激活ERK1/2信号通路减轻由缺氧复氧而引起的心肌细胞损伤，国外其他研究发现CT-1也参与PI3K-Akt信号通路。
　　 本实验通过对培养的乳鼠心肌细胞株进行缺氧复氧，CT-1，信号通路阻断剂等相关因素的干预，探讨CT-1在缺血后适应中对心肌细胞保护作用机制及参与的信号通路。
　　 目的：
　　 探讨心肌营养素1在缺血后适应中对心肌细胞保护作用机制及参与的信号通路。
　　 方法：
　　 1.细胞培养:将水浴锅预热至37℃，紫外线照射30min的超净工作台台面，用75％酒精擦拭，在超净工作台中按次序摆放消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。从液氮中取出冻存的H9C2细胞。迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化。用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再放入超净台内。制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管;加入培养基的量要达到10ml以上。在低速离心机上，以800rpm离心5分钟;吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞;活细胞计数，从1ml细胞悬液中取20ul加入台盼蓝染色液，染色5分钟;在血球计数板上计数活细胞数。将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。复苏细胞正常传2、3代后，取指数生长期的细胞进行实验。培养基为DMEM-高糖培养基添加10％胎牛血清。
　　 2.实验分为六组，相关因素干预:正常对照组:细胞用含10％新生牛血清的DMEM液正常培养，不经任何处理。缺氧复氧组:缺氧，用pH6.8 D-Hanks液在缺氧培养箱(95％N2，5％CO2，37℃)培养3h;复氧，缺氧3h之后用把pH6.8D-Hanks换成含10％新生牛血清DMEM液，在MCO-17AICO2培养箱(95％(O)2，5％CO2:，37℃)复氧3h。缺氧复氧+心肌营养素-1组:缺氧3h后加心肌营养素-1+复氧3h。缺氧后适应组:同缺氧复氧组，在复氧之前施加5 min复氧/5 min缺氧3个循环。缺氧后适应+心肌营养素1组:同缺氧复氧组，在缺氧3h后加入10ug/l心肌营养素1，再施加5min复氧/5min缺氧3个循环。复氧3h。缺氧后适应+心肌营养素1+Akt抑制剂组:在缺氧完成前30min加入20umol/l Akt抑制剂，缺氧完成后加入10ug/l心肌营养素1，再施加5min复氧/5min缺氧3个循环。复氧3h。缺氧后适应+心肌营养素1+二甲基亚砜组:Akt抑制剂换为二甲基亚砜，其他同缺氧后适应+心肌营养素1+Akt抑制剂组。
　　 3.对处理后的细胞进行检测:使用Thermo Fisher Scientific公司生产的multiscan MK3型号酶标仪，采用MTS法检测细胞存活率;使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，BD caliber流式细胞仪检测细胞凋亡率;使用上海康成生物公司生产的HRP标记的GAPDH优质内参，cell signal technology生产的一抗(phospho-Akt)，southern biotech生产的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG，采用Western Blot检测Akt蛋白表达;使用TOYOBO公司生产的SYBR Green PCRMaster Mix定量PCR用酶，ABI PRISM(@)7300 SequeNC siRNAe Detection System的定量PCR仪，采用Q-PCR检测Bad mRNA。
　　 结果：
　　 缺氧复氧组较正常对照组凋亡率明显增加，存活率降低;缺氧后适应组较缺氧复氧组凋亡率降低，存活率增加;缺氧后适应+CT1组较缺氧后适应组凋亡率进一步降低，存活率进一步增加。Akt磷酸化蛋白水平明显升高，Bad mRNA表达下调。加入Akt阻滞剂(A6730)后，缺氧后适应+CT1+Akt抑制剂组较缺氧后适应+CT1组凋亡率增加，存活率降低，Akt磷酸化蛋白水平下降，Bad mRNA表达升高，缺氧后适应+CT1+二甲基亚砜组较缺氧后适应+CT1+Akt抑制剂组凋亡率降低，存活率增加，Akt磷酸化蛋白水平明显升高，Bad mRNA表达下调，基本与缺氧后适应+CT1组持平。
　　 结论：
　　 心肌营养素1参与激活缺氧后适应Akt信号通路，协同缺氧后适应减轻缺氧复氧再灌注对心肌细胞的损伤，对心肌细胞起保护作用。