以cpsB基因测序为主的序贯分子生物学方法检测肺炎链球菌血清型及临床应用研究

本研究主要目的是以国内儿童肺炎链球菌血清型分布状况为基础，以分子生物学方法为手段，建立一种简单、实用、适合发展中国家使用的肺炎链球菌血清型检测“鸡尾酒”策略，即将cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR及血清型6A-6D特异PCR相结合，并将该策略运用于肺炎链球菌临床株血清型的测定，结合耐药性检测，对评价本地区疫苗的覆盖率和有效性，指导合理临床用药提供更好的流行病学证据。
　　第一部分 cpsB基因测序检测肺炎链球菌血清序列型
　　目的：利用已建立的cpsB基因测序方法对我们临床收集的肺炎链球菌株进行血清序列型检测，同时建立涵盖目前已知肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库，将该方法进一步完善，提高检测的准确性。
　　方法：下载GenBank中收录（截止2015年1月1日）肺炎链球菌所有cpsB基因全长的序列，应用GenBank中的ClustalW软件和/或Blastn软件对下载的序列进行列对、比对分析，建立肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库。对2009年～2013年收集的我院5岁以下住院儿童中肺炎链球菌性疾病不同样本来源不重复肺炎链球菌菌株193株，用特异性引物cps1/cps2进行单步PCR扩增cpsB基因目的片段，继之进行双向测序。测序结果与GenBank中的序列进行比对，参照我们建立的cpsB基因序列型数据库中数据确定血清型序列型。
　　结果：我们建立的数据库包括GenBank中（截止2015年1月1日）所有的390个含cpsB基因全长的GenBank收录号，包含目前所知肺炎链球菌95个血清型cpsB基因732bp标准序列型的数据资料。所有193株临床分离的肺炎链球菌菌株进行cpsB基因扩增均成功。基于cpsB基因在一个或多个位点的异质性，一共识别出21个序列型。其中8个序列型(3，9V，6B，10B，14，19A，23F，23A)是血清型特异序列型，可以由序列型直接预测出菌株的血清型;5个序列型(6C-6D，6B-6E-6X，15B-15C，19F-19A及28F-28A)是同一个血清群不同血清型共享序列型，可以由序列型直接预测出菌株相应的血清群;3个序列型(13-20，15A-33B，17A-34)虽然也属于多个血清型共享序列型，但无法明确菌株具体属于哪个血清型。通过cpsB基因测序方法，193株菌中34.2％的菌可直接确定其血清型;55.4％的菌可确定至相应血清群水平。
　　结论：本研究建立的肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库对分子生物学方法检测血清序列型是一个补充和完善。应用单步PCR进行cpsB基因测序确定肺炎链球菌血清序列型可以作为血清型检测的初筛。
　　第二部分 优化的序贯mPCR方法检测肺炎链球菌血清型
　　目的：根据我国儿童肺炎链球菌血清型分布状况，对美国CDC推荐的序贯mPCR方法进行优化组合，建立一个适合我国儿童血清型检测的序贯mPCR方法，可以在最初三个mPCR反应中识别出最常见血清型。
　　方法：采用优化的序贯mPCR方法对收集的193株菌进行肺炎链球菌血清型检测。参照美国CDC网站公布的引物序列合成肺炎链球菌40对血清型特异性引物和1对荚膜特异性引物。根据我国儿童肺炎链球菌血清型分布状况，对美国CDC推荐的序贯mPCR前三步反应中引物进行优化组合。优化后的前三步mPCR反应可识别十个血清群/型，包括我国儿童最常见血清群/型19F，19A，14，23F及6，PCV-7中包含的三个血清型4，9V/9A及18C，以及近些年在血清型替换中越来越受到关注的血清型15B/15C和15A/15F。第一步mPCR反应包含血清群/型9V/9A、14、23F、15B/15C的特异性引物;第二步mPCR反应包含血清群/型4，6和19A的特异性引物;第三步mPCR反应包含血清型15A/15F，18C和19F的特异性引物。每一步mPCR反应中均加入荚膜特异性引物作为内部阳性对照。如果一个标本在前三步mPCR反应中检测均阴性，则需要按照美国CDC推荐的方法进行序贯8个mPCR反应。
　　结果：从193株临床肺炎链球菌菌株中一共识别出肺炎链球菌12个血清群/型，包括:3（2株），6(27株)，9V/9A（3株），14（14株），15F/15A（2株），15B/15C（13株），19F（67株），19A（23株），20（2株），23F（33株），23A（2株）和34（1株）。血清型4和18C在本研究中没有该型菌株，故扩增阴性。通过优化的序贯mPCR前三步反应可识别大多数菌株的血清型，仅11株菌(5.7％)需要进行美国CDC推荐的序贯8步mPCR反应鉴定，其中4株菌(2.1％)改用后者依然不能进行分型。序贯mP.CR方法无法分型的4株菌中2株菌cpsB基因测序显示序列型为10B，28F-28A。另有2株菌应用两种方法均无法分型，需要进行荚膜肿胀试验鉴定。cpsB基因测序与mPCR结果相比，两者一致性可达92.2％。cpsB基因测序提示序列型是15A-33B，13-20A-20B，17A-34，序贯mPCR确定其血清型分别为15F/15A，20以及34，并证实13株肺炎链球菌cpsB基因血清序列型为新的序列型。
　　结论：根据中国儿童血清型分布状况，优化的序贯mPCR反应用于肺炎链球菌血清分型可以弥补基因测序的不足，提高检测准确性，并且在前三步mPCR反应中识别出常见血清型。
　　第三部分 血清型6A-6D特异PCR方法检测血清6群肺炎链球菌
　　目的：应用我们已建立的血清型6A-6D特异PCR方法对cpsB基因测序及序贯mPCR识别出的肺炎链球菌血清6群菌株进一步细分其血清型。
　　方法：收集cpsB基因测序及序贯mPCR方法均鉴定为血清6群的27株肺炎链球菌菌株DNA。用特异性引物wciP584aS/wciP-r(6B)和wciP584gS/wciP-r(6A)，通过单步PCR扩增wciP基因，初步将血清6群菌株区分为血清型6A/6C与6B/6D;对血清型6A/6C与6B/6D菌株，用特异性引物wciNβS1/wciNβA2再次采用单步PCR扩增wciNβ基因，从6A/6C与6B/6D中分别区分血清型6C与6D菌株。
　　结果：27株cpsB测序和序贯mPCR方法均鉴定为血清6群的肺炎链球菌，我们采用血清型6A-6D特异PCR细分血清型，发现12株血清型6A(12/27，44.4％)，13株6B(13/27，48.1％)，2株6C(2/27，7.4％)，没有发现6D菌株。
　　结论：本研究再次证实血清型6A-6D特异PCR方法能快速、简单、有效的区分血清6群肺炎链球菌。
　　第四部分 cpsB基因测序辅以mPCR、血清型6A-6D特异PCR检测肺炎链球菌血清型的“鸡尾酒”策略及临床应用
　　目的：应用cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR、血清型6A-6D特异PCR的肺炎链球菌血清分型“鸡尾酒”策略，对我院临床收集193株肺炎链球菌进行血清分型，并对耐药性进行检测。旨在寻找一种适合于我国流行病学调查和研究的肺炎链球菌血清分型策略，并提供直接来自社区的肺炎链球菌血清型、耐药性、疫苗覆盖情况等资料。
　　方法：收集2009年～2013年我院5岁以下住院儿童中肺炎链球菌性疾病的肺炎链球菌193株。首先采用cpsB基因测序初筛，确定血清序列型;对cpsB基因测序有歧义的结果或不能分型、新的cpsB序列型菌株应用优化的序贯mPCR方法明确血清型;对上述方法确定为血清6群的菌株应用血清型6A-6D特异PCR方法细分血清型6A，6B，6C和6D。将本次研究中发现新的cpsB基因序列上传GenBank。采用K-B法对193株菌进行抗菌素药物敏感试验，根据美国临床和实验室标准委员会(CLSI)2013年版标准进行判读。
　　结果：193株肺炎链球菌中共识别出16个血清型。初筛后，59.5％菌株序列型的结果需要进一步采用优化的序贯mPCR方法给予明确。大多数菌株血清型在序贯mPCR的前3个反应中可以识别，仅5.7％的菌株需要进行8个mPCR反应。多重耐药菌比例高达86.8％，最常见耐药模式:红霉素+克林霉素+复方新诺明。按非脑膜炎标准未检测出耐青霉素肺炎链球菌，按脑膜炎标准和口服标准对青霉素耐药性显著增加，分别为88.6％和39.2％。
　　结论：(1)对国内尚无法采用传统荚膜肿胀试验进行SP血清分型的地区，本研究建立的cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR、血清型6A-6D特异PCR的“鸡尾酒”策略是一个值得推广的分子生物学检测策略;(2)血清型19A已经成为南方沿海地区一个常见的血清型;PCV-13血清覆盖率高，可为本地区儿童提供更好的免疫保护;血清15群（尤其15B/15C）的比例高于国内其它地区报道值得引起关注;(3)小于5岁儿童肺炎链球菌多重耐药比例高，应避免使用红霉素、克林霉素和复方新诺明治疗PDs，对非脑膜炎SP感染临床医生仍可选用青霉素，避免选择压力，保护三代头孢菌素敏感性，脑膜炎SP感染则需参考药敏结果选择敏感抗生素。