MiR-20a对破骨细胞分化的影响及其作用机制的研究

背景和目的
　　牙周病是由多种革兰氏阴性菌引起感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌是牙周病主要致病菌。脂多糖是牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子，对宿主细胞具有破坏作用。因此，细菌感染可引起牙周组织的炎症反应，进而引起牙槽骨的破坏和牙齿脱落。牙周病导致的牙槽骨吸收过程受破骨细胞调控。
　　破骨细胞来源于造血干细胞的单核/巨噬细胞系统。THP-1细胞可分化成成熟的巨噬细胞，进而诱导分化成为破骨细胞。许多细胞因子可以正性或负性调节破骨细胞增殖、存活、分化和功能。M-CSF和RANKL可由成骨细胞或活化的T细胞产生，是调控破骨细胞重要的细胞因子。RANKL可以诱导活化T细胞核因子1(NFATc1)的表达。活化T细胞核因子1可以和破骨细胞相关基因如如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶K等结合，参与破骨细胞分化和成熟。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一段由19-22个核苷酸组成的非编码的小分子RNA，对基因转录后水平进行调控。microRNAs主要参与调控成骨细胞，破骨细胞以及骨细胞的分化、增殖以及功能，从而参与胚胎期骨质发育和成年骨组织功能的保持。
　　MiR-20a是miR-17-92基因簇的典型代表，miR-17-92基因簇是研究较为广泛的家族之一。文献报道，miR-17-92基因簇在单核细胞分化和成熟中具有关键作用。MiR-17-92基因簇不仅参与骨骼形成过程，而且在保持骨骼功能正常方面具有重要作用。研究表明，许多miRNAs都参与成骨细胞分化、增殖以及形成过程。研究证实，miR-20a可以负性调节BMP信号通路的抑制剂如Bambi和Crim1的表达水平。进一步的研究还发现，miR-20a可以上调BMP2，BMP4，Runx2， OSX/Sp7，Ocn和Opn的表达，从而促进骨形成。近年来，miRNAs在破骨细胞方面的作用受到普遍关注。但是miR-20a对破骨细胞的功能和分化的研究还未见报道。
　　MiR-20a可在多种组织和细胞内高度表达。它通过靶向不同基因，从而调控肿瘤，免疫疾病的发生，骨骼肌肉细胞等的分化，抑制内皮细胞的迁移，受损血管的修复。PPARγ是miR-20a调控一个重要的靶向基因。文献表明，miR-20a表达上调可以导致小鼠表达成脂的PPARγ基因的蛋白水平水平升高。在骨组织的代谢中，miR-20a可以靶向PPARγ基因对成骨细胞分化起到调控作用。抑癌基因PTEN位于染色体10q23区域。在乳腺癌，卵巢癌，肝癌，肠癌中，PTEN也是miR-20a调控一个重要的靶向基因。近年研究已经证实，PTEN在调控细胞一系列活动如增殖，粘附，迁移，入侵，细胞凋亡等信号通路中发挥着重要的作用。
　　本实验分三部分进行，首先检测miR-20a对THP-1细胞生物学性能的影响其中包括转染实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验和细胞增殖实验。其次探讨miR-20a对破骨细胞分化的影响，最后检测在LPS作用下，miR-20a对破骨细胞分化的影响，通过RT-PCR和Western Blot检测TRAP、NFATc1表达以及靶基因PPARγ，PTEN分子水平和蛋白水平表达情况，
　　方法
　　1.miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响
　　人THP-1细胞在加入含10％FBS的1640培养液中培养，细胞培养至较高密度时，向6孔板各孔加入PMA，使各孔终浓度为10ng/ml。72h后，细胞贴壁，用PBS轻轻漂洗3次。实验分5组，空白对照组，Mimics NC组，miR-20a mimics组，InhibitorNC组，miR-20a inhibitor组。根据转染效率评价的结果，转染试剂Lipofectamin2000，用于转染各oligo，于转染24h后，收取细胞，用于RT-PCR检测。
　　将上述转染的5组(空白对照组，Mimics NC组，miR-20a mimics组，InhibitorNC组，miR-20a inhibitor组)细胞种入96孔板中，避光加入CCK-8试剂，酶标仪450nm波长测其OD值，得到数据。细胞转染至48h后，PBS洗细胞，加入细胞70％乙醇固定至少12小时，再次PBS洗细胞，加入1mLPI工作液室温避光染色30分钟。通过FSC/SSC散点图收集细胞，利用Flowjo软件处理。细胞转染至48h后，离心收集细胞，微量离心机转速1000RPM，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM，离心时间5min收集细胞)。用400ul的Binding Buffer重悬细胞。在细胞悬液中避光加入5ul AnnexinV-FITC染液，4℃反应15min。反应后再避光加入10ul的PI混匀，4℃反应5min。在1小时内用流式细胞仪检测。
　　2.转染miR-20a，检测破骨细胞分化中TRAP，NFATc1， PPARγ，PTEN基因表达
　　THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时，再加入含10％FBS的1640培养液，向6孔板各孔加入PMA，使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后，根据转染效率评价的结果，转染试剂Lipo fectamin2000，用于转染各oligo。实验分三组，空白对照组，Mimics NC组，Mimic-20a组。6h后换液，并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养，并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h，收取一套复孔进行TRAP染色与计数，一套复孔收取Western样品，一套复孔收取RT-PCR样品。
　　3.转染miR-20a，检测在LPS作用下，破骨细胞分化中TRAP，NFATc1，PPARγ，PTEN基因表达
　　THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时，加入含10％F BS的1640培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。向6孔板各孔加入PMA，使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后，根据转染效率评价的结果，转染试剂Lipo fectamin2000，用于转染各oligo。实验分三组，空白对照组，Mimics NC组，Mimic-20a组。6h后换液，并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养，并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h，在三组中加入PG-LPS，使得用药终浓度为1ug/ml，于PG-LPS加药24h收取细胞样品，一套复孔进行TRAP染色与计数，一套复孔收取Western样品，一套复孔收取RT-PCR样品。
　　结果
　　1、miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响
　　实验中，我们使用CCK8法检测miR-20a对THP-1细胞增殖的影响。结果证实，与空白对照组相比，miR-20a过表达和miR-20a抑制剂均抑制了THP-1细胞的增殖。但是对THP-1细胞的抑制作用在转染后的第三天最为显著。
　　我们检测miR-20a转染THP-1细胞48h后，对THP-1细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果显示，miR-20a过表达组与空白对照组相比，细胞周期中S期的不同具有统计学意义。然而miR-20a抑制组与空白对照组相比，不同在于G1期和S期。我们推论，miR-20a通过延长G1期，缩短了S期，阻滞了G1/S期时相转换，抑制了THP-1细胞的生长和增殖。
　　进而我们使用流式细胞仪验证miR-20a对THP-1细胞增殖的抑制作用是否是由于MiR-20a促进了THP-1细胞凋亡所致。结果显示，和空白对照组相比，miR-20a转染48h后， miR-20a过表达抑制了早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞，促进了活细胞的增殖。然而miR-20a抑制剂呈现出促进细胞凋亡的趋势。因此，我们得出结论，miR-20a对于THP-1细胞增殖的抑制不是由于抑制细胞凋亡所致，miR-20a对于细胞增殖和细胞凋亡的影响是来源于不同的两个信号通路。
　　2、转染miR-20a，检测破骨细胞分化中TRAP，NFATc1， PPARγ，PTEN基因表达
　　为了证实miR-20a在破骨细胞分化过程中的作用，我们先使用PMA处理THP-1细胞分化为巨噬细胞，再将miR-20a转染至贴壁的巨噬细胞中，在M-CSF和RANKL诱导剂的诱导下继续培养3天，应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATc1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中具有关键作用的转录因子，研究显示，与空白对照组和NC对照相比，miR-20a过表达组，TRAP和NFATC1的mRNA水平和蛋白水平明显下降，提示在M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞分化中，miR-20a起到抑制的作用。
　　本实验选择PPARγ作为miR-20a预测的靶基因。为了证实PPARγ是否是miR-20a靶向目的基因，我们使用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测了在M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化过程中，miR-20a过表达情况下，PPARγ的分子水平和蛋白水平的表达情况。实验结果显示，与空白对照组和NC对照组相比，在RANKL诱导破骨细胞分化过程中，miR-20a下调了PPARγ基因的mRNA水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测结果发现，与空白对照组和NC对照组相比，在RANKL诱导破骨细胞分化过程中，miR-20a下调了PTENmRNA水平。但是，我们并没有检测到PTEN蛋白水平的变化。因此，我们推测，PPARγ是miR-20a在RANKL诱导THP-1破骨细胞分化中的靶向基因。
　　3.转染miR-20a，检测在LPS作用下，破骨细胞分化中TRAP，NFATc1，PPARγ，PTEN基因表达
　　我们首先使用PMA处理THP-1细胞72h，再将miR-20a转染至贴壁的THP-1细胞中，加入M-CSF和RANKL诱导剂，继续诱导培养3天，加入LPS，24h后应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATC1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中起关键作用的转录因子，我们研究证实，与空白对照组和NC对照相比，miR-20a过表达组，TRAP，NFATc1的mRNA水平明显升高。我们结果表明，在LPS作用下，miR-20a对RANKL诱导破骨细胞起到促进的作用。
　　本实验采用人THP-1细胞，在PMA诱导贴壁，转入miR-20a-Mimic和NC-FAM，在M-CSF和RANKL诱导THP-1细胞破骨分化72h，加入LPS刺激24h，采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法，检测PPARγ和PTEN的分子水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR结果显示，与空白对照组和NC对照组相比，在M-CSF和RANKL诱导下，PTENmRNA水平和PPARγmRNA明显升高。蛋白免疫印迹法检测PTEN和PPARγ蛋白水平，实验发现，相比于空白对照组，在LPS作用下，PPARγ蛋白水平明显升高，但是PTEN的蛋白水平与空白对照组相比没有变化。因此，我们推测，在LPS作用下，PPARγ仍然是miR-20a的靶向基因，PPARγ的上调促进了THP-1破骨细胞的分化和成熟。
　　结论
　　1、miR-20a抑制细胞增殖，阻滞G1/S时相的转换，对细胞凋亡呈现抑制作用。
　　2、miR-20a对破骨细胞分化具有抑制作用，靶向PPARγ基因。
　　3、在LPS作用下，miR-20a对破骨细胞分化具有促进作用，靶向PPARγ基因