酵母细胞酶法催化合成谷胱甘肽研究

谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有Υ-谷氨酰基和巯基的三肽化合物,这两种结构是谷胱甘肽许多重要生理功能的基础,如Υ-谷氨酰胺键参与氨基酸的转运;甘氨酸和半胱氨酸残基参与胆酸的代谢;分子中的巯基参与中和自由基解毒等重要生理功能,在食品工业和医药中具有重要的应用前景。本文主要研究内容如下:
　　 1.实验收集培养了9株酵母菌,分别测定他们的细胞生物量和胞内谷胱甘肽(GSH)含量,酿酒酵母SP004细胞干重达到11.39g/L,啤酒酵母TSO13胞内GSH含量达到1.5282mg/gwetcells;验证考察了4种不同提取方法对细胞内GSH含量测定的影响,结果表明,温差破碎法提取效果较好。同时比较9株酵母菌催化合成GSH的能力,结果显示,絮凝酵母SP5GSH合成酶系活力相对较高,酶活达到2.385mg/g湿细胞,每克湿细胞催化前体AA合成GSH转化率为7.76％。
　　 2.用单因素试验考察不同反应液体积与菌体量比、硫酸镁浓度、磷酸钾缓冲液浓度、葡萄糖浓度、反应温度以及振荡反应速度对絮凝酵母SP5细胞催化前体AA合成GSH的影响;正交试验分析法研究不同反应液体积与菌体量比、硫酸镁浓度、磷酸钾缓冲液浓度以及葡萄糖浓度4个因素的交互作用。结果表明,合成GSH的适宜条件为:谷氨酸60mmol/L、半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸20mmol/L、七水合硫酸镁20mmol/L、葡萄糖0.5mol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液100mmol/L,30℃下,200r/min,振荡反应时间6h。在此条件下,絮凝酵母SP5细胞GSH合成酶系活力平均达到2.9498mg/g湿细胞,每克絮凝酵母SP5湿细胞催化前体AA合成GSH的转化率平均为9.60%,比初始反应条件下的AA转化率提高了23.68%。
　　 3.通过单因素实验,分析了培养温度、发酵培养基起始pH值、摇瓶装液量、接种量、发酵培养基碳源、有机氮源以及无机氮源7个因素对絮凝酵母SP5细胞生物量以及催化合成GSH的影响;正交试验分析发酵培养基碳源、有机氮源以及无机氮源这三个因素的交互作用,确定了较优的发酵条件如下:培养温度30℃,起始pH值7.0,摇瓶装液量20%(250mL锥形瓶),接种量5%,培养基组成:蔗糖30g/L,蛋白胨25g/L,硫酸铵58/L,KH2PO41.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,肌醇0.1/L,在此条件下絮凝酵母SP5催化前体AA合成GSH的转化率达到10.98%,比初始条件下转化率提高了14.38%。
　　 4.为改善絮凝酵母SP5细胞通透性,提高其催化合成GSH的转化率,实验采用TritonX-100、Tween80、SDS三种不同的表面活性剂,分别配制成浓度为0.01%、0.1%、1%的溶液,考察细胞通透性对催化合成GSH的影响,实验结果表明1%浓度的TritonX-10030℃处理2h时效果较好,对其浓度及时间做进一步优化后,0.5%浓度的TritonX-10030℃下处理2h效果较好,此条件下絮凝酵母SP5催化前体AA合成GSH的转化率达到14.65%,比未经过表面活性剂溶液处理的酵母细胞转化率提高了33.42%。