PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪变性的调控作用

研究背景和目的:
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在近几十年已经成为常见的公共健康问题。NAFLD包含了从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的临床疾病状态,能发展为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。目前广泛接受的理论是“二次打击”学说,该学说认为,以胰岛素抵抗为首的“一次打击”是引起肝细胞脂肪变性的主要原因,在此基础上,以内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)、线粒体功能障碍为标志的“二次打击”导致了单纯性脂肪肝向NASH的演进。
　　ERS在NASH肝细胞损伤中发挥重要作用,是目前的研究热点,但机制不明。结合免疫球蛋白Bip,又称GRP78或HspA5,是位于内质网中重要的分子伴侣,被认为是内质网应激标志性蛋白之一。剪切型X盒结合蛋白XBP-1s(spliced X-box binding protein1)不仅可以与内质网应激的反应元件(endoplasmic reticulum stress response element,ERSE)结合诱导Bip、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)基因的转录活性,而且能够诱导内质网降解增强因子-α甘露糖苷酶样蛋白(ER degradation-enhancing-mannosidase-like protein,EDEM)基因的转录,因此XBP-1s表达上调被认为是内质网应激的另一标志。
　　蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是存在于哺乳动物细胞胞浆内的丝/苏氨酸蛋白激酶,具有脂质依赖性,至少包括12种亚型。PKCδ是新型PKC( novel PKC, nPKC)家族成员,主要在肝脏组织中发挥作用。与cPKC和aPKC不同,PKCδ能被游离脂肪酸的代谢产物二酰甘油(diacylglycerol,DAG)激活,并通过激活应激活化蛋白激酶(c—jun N—terminal kinase,JNK)和CHOP,促进肝细胞凋亡的发生。研究发现,PKCδ激活与糖尿病及其相关疾病发病机制密切相关。将编码PKCδ的Prkcd基因经整体或者肝特异性敲除后,小鼠肝脏胰岛素敏感性得到明显改善。与高脂饮食饲养野生型同窝对照小鼠相比较,Prkcd-/-小鼠肝脏和血浆甘油三酯水平及附睾脂肪组织都减少。这些线索提示:在NASH发生发展过程中,PKCδ参与肝细胞脂肪变性过程,其激活很可能是诱导ERS持续发生导致肝细胞脂肪变进展至NASH发生的关键环节,但目前尚无PKCδ与ERS之间关系的研究。因此,本研究目的在于初步探讨PKCδ与肝细胞脂肪变性、内质网应激的关系,为防治非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFL)向NASH的演进提供新思路。
　　方法:
　　1.构建肝细胞株L02脂肪变性体外模型
　　1.1.人正常肝细胞株L02培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基,造模前细胞进行胎牛血清剥夺过夜。对照组培养于含1% FAF-BSA的DMEM培养基培养,脂肪酸组给予0.5mM长链游离脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFA),油酸/棕榈酸酯,2:1。根据诱导脂肪变的时间,脂肪酸组分为2h组、4h组、8h组和16h组。
　　1.2.油红O染色检测各组细胞内脂滴含量。
　　1.3.检测各组细胞内甘油三酯(TG)含量。
　　2.Real-time PCR检测PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。
　　3.Western-blot检测PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表达变化。
　　4.检测PKCδ对内质网应激标志蛋白Bip、XBP-1s的影响。
　　4.1.利用siRNA瞬时转染技术降低PKCδ基因的表达。
　　4.2.检测干扰PKCδ表达后Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。
　　4.3.检测干扰PKCδ表达后Bip、XBP-1s的蛋白水平的表达变化。
　　5.检测干扰PKCδ表达后对L02肝细胞脂肪变性程度的影响。
　　6.利用SPSS18.0软件,对各项实验数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1.油酸/棕榈酸(2:1)体外诱导成功建立L02细胞脂肪变性模型
　　油红O染色检测脂肪酸组细胞内橘红色脂滴明显增多,且随着培养时间的延长脂滴越为明显。ImageJ2X图像分析提示L02细胞单个细胞平均脂变面积显示,脂肪酸组较对照组脂滴含量明显增多(P<0.01)。经油酸、棕榈酸诱导处理后的L02细胞内TG含量也随培养时间的延长而升高,明显高于对照组(P<0.05)。
　　2.Real-time PCR检测PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。
　　与对照组相比,脂肪酸组的L02细胞 PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平显著增加,且具有时间依赖效应(P<0.05)。
　　3.Western-blot检测PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表达变化。
　　脂肪酸组PKCδ、Bip、XBP-1s蛋白水平的表达均较对照组增高。利用PKCδ充分激活所必须的磷酸化位点 Thr-505检测 PKCδ激活状态,与对照组相比,混合脂肪酸刺激L02肝细胞早期阶段,PKCδ磷酸化表达明显升高,以4h组最为显著,后期出现下降趋势。
　　4.干扰PKCδ表达后对L02细胞Bip、XBP-1s的影响
　　Real-time PCR和Western-blot检测转染后细胞中 Bip、XBP-1s的表达变化,在PKCδsiRNA转染组细胞中,加入脂肪酸培养8h后Bip、XBP-1s表达虽然仍有升高,但程度明显低于对照转染组(P<0.05)。
　　干扰PKCδ表达后对L02肝细胞脂肪变性程度的影响
　　油红O染色检测脂肪变性阳性细胞率,脂肪酸诱导PKCδsiRNA转染组细胞染色阳性率明显低于对照组细胞(P<0.01), PKCδsiRNA转染组细胞TG含量也显著低于对照组(P<0.05)。
　　结论:
　　1.肝细胞脂肪变性过程中,PKCδ及其磷酸化表达、Bip、XBP-1s表达上调,具有时间依赖效应。
　　2.通过siRNA瞬时转染技术降低PKCδ表达能够有效抑制混合脂肪酸诱导内质网应激标志蛋白Bip和XBP-1s的表达,一定程度减轻肝细胞脂肪变性。
　　3.PKCδ可能是NASH发生过程中联系肝细胞脂质过载和内质网应激的关键点。PKCδ的上调可诱导脂质在内质网腔内蓄积并启动内质网应激的发生。